PGS السقالات المرنة في هندسة الأنسجة الشرياني

يوضح هذا الفيديو كيفية تصنيع سبيكات أنبوبية مسامية وإخضاعها لتهيئة ميكانيكية ديناميكية لهندسة الأنسجة الشريانية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تصنيع السبيكات باستخدام مطاط حيوي قابل للتحلل وطريقة الاندماج الحراري. ثم يتم تحضير السبيكات لاستزراع الخلايا وتجميعها في نظام مفاعل حيوي.

في المفاعل الحيوي، يتم استزراع خلايا العضلات الملساء الوعائية على السقالات ثم تُنمّى. وبعد عدة أسابيع، يتم حصاد النسيج وتحليله باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح، وصبغة h and e، والتألق الذاتي للإيلاستين. وتكون العضلات الملساء الناتجة متعددة الطبقات وموجهة بشكل عمودي.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية، على غرار التبييض الجسيمي، في استخدام قالب زجاجي لتصنيع سقالة أنبوبية مسامية من حمض الهيالورونيك. ولإزالة القالب، يتم تحضير قالب السقالة من قطعة من الأنابيب الزجاجية. ضع الأنبوب في حامل، ثم صب محلول حمض الهيالورونيك الذي تم تحضيره في اليوم السابق داخل الأنبوب.

يتدفق حمض الهيالورونيك ببطء على طول الجدار الداخلي. وعندما يصل إلى قاع القالب، اقلب القالب. كرر هذه الخطوة حتى يتم طلاء الجدار الداخلي للقالب بالمحلول بشكل متساوٍ.

بعد الطلاء، يتم تجفيف جميع القوالب الزجاجية المُحضرة في فرن تفريغ عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. وعادةً ما يتم تحضير أربعة قوالب بالتزامن مع تجفيف القوالب الزجاجية. ثم يتم تحضير صبات جزيئات الملح، وذلك بطحن جزيئات ملح SVE حتى تصل إلى حجم يتراوح بين 25 إلى 32 ميكرومتر.

في اليوم التالي، قم بتجميع محور قالب الزجاج المجهز، وأنابيب PTFE، والكم الغشائي القابل للانكماش الحراري وحلقة PTFE. أولاً، أدخل المحور في قطع من أنابيب PTFE بطول 65 millimeter ثم قم بخبزها عند 120 degrees Celsius لمدة خمس دقائق. ولتقليص PTFE أثناء الانتظار، قم بتسخين حاضنة التهجين مسبقاً عند 37 degrees Celsius لمدة 30 minutes على الأقل.

بمجرد أن يغلف الأنبوب الركائز، ادفع غلاف الانكماش الحراري فوق الركيزة بحيث يتحرك بحرية. ثم ضع الركيزة داخل القالب الزجاجي وثبّت حلقة A-P-T-F-E في الجزء السفلي من الركيزة. تأكد من أن حلقة PTFE مثبتة بإحكام في الجزء السفلي من القالب الزجاجي.

بعد ذلك، باستخدام ملعقة مسطحة وقمع من مطاط السيليكون، أضف عجينة جزيئات الملح إلى القالب الزجاجي. ثم انقر على القالب برفق باستخدام الملعقة المسطحة لضمان توزيع الجزيئات بشكل متساوٍ، واكشط الملح الزائد. والآن، أوقف تشغيل الحاضنة المسخنة وقم بتحميل القوالب المحشوة بالملح فيها بسرعة؛ حيث سينصهر الملح خلال الـ 30 دقيقة القادمة، وبعد ذلك جفف القوالب في فرن تفريغ عند 37 degrees Celsius لمدة 24 ساعة.

في اليوم التالي وبعد التبريد، قم بإزالة المندريل المصنوع من الفولاذ المقاوم للصدأ من القوالب عن طريق دفعه للخارج مع تثبيت حلقة PTFE. استعن بكماشة مدببة عند الحاجة. ثم قم بإزالة حلقة PTFE من الجزء السفلي من القالب.

بعد ذلك، قم بخبز القوالب لتقليص الغلاف، ثم أخرج الأغلفة المتقلصة من القوالب. اترك القوالب تبرد حتى يحين وقت استخدامها، ثم خزنها في مجفف داخل خزانة سحب الغازات. باستخدام قطّارة، أمل القوالب الزجاجية بزاوية 45 درجة، ثم أسقط محلول PGS في تجويفها الداخلي مع تدوير القالب ببطء.

تحقق مما إذا كان محلول PGS يتدفق إلى أسفل على طول جدار القالب. وفي حالة وجود بقعة جافة، أضف المزيد من PGS. اترك THF الآن ليتبخر في خزانة سحب الغازات لمدة 30 دقيقة على الأقل. وبمجرد تبخر THF، قم بمعالجة القوالب في فرن تفريغ.

بعد المعالجة لمدة يوم واحد، بَرِّد القوالب حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة، ثم اغمرها ببطء وبشكل رأسي في ماء منزوع الأيونات عند درجة حرارة 24 °C. حيث يؤدي إمالتها بسرعة كبيرة إلى تكوين فقاعات هوائية، مما يتسبب في تمزق السقالة. انقل القوالب بعناية إلى الحمام المائي.

ضعها بزاوية مائلة باستخدام أنبوب سيليكون، واترك حمض الهيالورونيك ليذوب على مدار ساعة. إذا لم يتحرر حمض الهيالورونيك من القالب بعد مرور ساعة، فاستخدم ملعقة مسطحة (spatula) لدفع حمض الهيالورونيك ببطء من كلا الطرفين بينما لا يزال القالب مغموراً، ثم هز القالب ببطء. الآن، تحقق من عدم تحرك السقالات داخل القالب الزجاجي، وفي حال تحركها، اسحب السقالة ببطء باستخدام ملقط لتحريرها من القالب.

بعد ذلك، يتم استخلاص جزيئات الملح عن طريق نقل السقالات الرقيقة بعناية إلى حمام من الماء منزوع الأيونات مع التقليب برفق. تستغرق هذه العملية ثلاثة أيام على الأقل وتتطلب تغيير الماء يومياً. بعد استخلاص الملح بالكامل، ينقل كل سـقالة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 milliliter مليء بالماء منزوع الأيونات وتجميدها في صندوق ثلج جاف لمدة ساعة. توضع أنابيب الطرد المركزي المجمدة في جهاز التجفيد (lyophilizer) لمدة ثلاثة أيام مع ترك الأغطية مفتوحة.

بمجرد إتمام عملية التجفيف بالتجميد، تُخزن السقالات في مجفف حتى يحين وقت استخدامها. ابدأ بقطع السقالات إلى أطوال تتراوح بين 25 إلى 30 millimeter. بعد ذلك، جهز سدادتين من مطاط السيليكون عن طريق تمرير أنابيب PTFE عبر الثقوب الوسطى لكل سدادة.

بعد ذلك، يتم قص حلقات hs بأطوال تبلغ 1.5 millimeter وإنزلاق حلقة واحدة في أحد طرفي السقالة. يتم دفع أنبوب PTFE واحد متصل بالسدادة في نفس طرف السقالة مع تداخل بسيط بما يكفي ليكون تحت حلقة HS لربط السقالة بإحكام بالأنبوب، ثم تُكمّش حلقة HS في الفرن وتُترك المجموعة لتبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة. الآن، يتم إدخال أنبوب بولي كربونات بطول 50 millimeter، والذي يعمل كغرفة للمفاعل الحيوي، فوق السقالة وتثبيته عند السطح الداخلي لسدادة المطاط السيليكوني.

تماماً كما في السابق، يتم تثبيت أنبوب PTFE آخر وسدادة عند الطرف الآخر من السقالة باستخدام حلقة hs لإكمال الغرفة. وتُربط السدادة الثانية بالطرف الآخر من أنبوب البولي كربونات. بعد ذلك، يتم تثبيت الأسطح الخارجية للسدادات بلوحين من سبائك الألومنيوم.

أدخل قضيبين ملولبين في الفتحة الجانبية لكل لوحة وثبّت اللوحات باستخدام براغي تثبيت يدوية. قم بتركيب السقالة في المفاعل الحيوي. الآن قم بقياس الطول المرئي لكل سقالة، وهو المسافة بين حلقتي hs، واحسب مساحات سطحها الداخلية.

لبذر الخلايا. في جهاز التعقيم (autoclave)، يتم تعقيم الغرف بعد تغليف كل منها على حدة بورق القصدير، جنباً إلى جنب مع كل جزء من وحدة المفاعل الحيوي. وبمجرد التعقيم، يتم تجميع المفاعل الحيوي داخل غطاء استزراع الخلايا.

قم بمعالجة السقالة مسبقاً وشطفها بسلسلة من عمليات التروية باستخدام مضخة 연دية (peristaltic pump) بمعدل تدفق 1 mm/min في دائرة التدفق. ابدأ بالشطف باستخدام ethanol بتركيز 70%، ثم ethanol بتركيز 50%، ثم ethanol بتركيز 25% لمدة ساعة واحدة لكل منهما. اتبع عمليات الشطف الثلاثة بـ ethanol بعملية شطف بمحلول PBS لمدة ساعتين.

أخيرًا، يتم تروية المفاعل الحيوي بوسط زراعة خلايا SMC لمدة 24 ساعة، وبعد ذلك يصبح جاهزًا لاستزراع الخلايا وبدء التجارب. الآن، وباتباع التعليمات الواردة في المخطوطة المرفقة، يتم استزراع المفاعل الحيوي بـ 2 million خلية لكل سنتيمتر مربع، وعلى مدار الـ 21 يومًا التالية، يتم تغيير أوساط الأنابيب وإجراء تعديلات على سرعة المضخة. تدريجيًا، سيزداد الضغط في البنية المُصنعة من حوالي 4 mmHg في اليوم الأول من الزراعة إلى أكثر من 100 mmHg بعد أسبوعين من الزراعة، وبعد ثلاثة أسابيع من الزراعة، يتم حصاد الخلايا وتحضيرها للتحليل كما هو محدد في المخطوطة المرفقة.

تم تصنيع هذه السقالات الأنبوبية من مادة PGS باستخدام طريقة صهر الملح. وأظهرت الصور المجهرية الإلكترونية الماسحة أن جميع السقالات تمتعت بسماكة جدران متجانسة، مع خلو مقاطعها العرضية من أي عيوب جزئية. كما لوحظ وجود مسام كبيرة ودقيقة موزعة عشوائياً على السطح اللمعي لجميع السقالات.

بعد زراعة الخلايا، نمت خلايا العضلات الملساء (SMCs) متعددة الطبقات باتجاه عمودي على اتجاه التدفق. علاوة على ذلك، غطت الخلايا وبروتينات المصفوفة خارج الخلوية المشتقة (DCM) تجويف جميع نماذج الـ PGS بالكامل. كما أظهر الفلورية الذاتية للإيلاستين وجود ألياف مرنة منظمة محيطياً عند السطح التجويفي للنموذج.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون قد اكتسبت فهماً لكيفية صنع سِقالة أنبوبية مسامية، ورؤية الخلايا، وزراعة السِقالة باستخدام مفاعل حيوي مصمم مسبقاً.