الكروماتوجراف الدهون تقارب الحويصلة بوساطة الفرز المغناطيسي باستخدام خلية المنشط (LIMACS) : طريقة جديدة لتحليل البروتين الدهني التفاعل

صُممت هذه التجربة لتحديد البروتينات الرابطة للدهون وتحليل التفاعل بين البروتينات والدهون في بيئة غشائية محددة من الحويصلات الدهنية؛ حيث يتم تحضين بروتينات متجانس الخلية مع حويصلات دهنية مُحضّرة حديثاً من الفوسفاتيديل سيرين والسيراميد. بعد ذلك، يُضاف إلى خليط التفاعل حبيبات مغناطيسية مقترنة بـ Xin V لتثبيت البروتينات المرتبطة بالحويصلات الدهنية على الحبيبات المغناطيسية. وفي الخطوة التالية، يتم تنقية الحويصلات الدهنية البروتينية عن طريق الفرز الخلوي المنشط مغناطيسياً.

لتحديد نتائج البروتين المرتبط بالليبيد الموضحة، استخدم تقنية Western blotting عبر SDS page لإظهار تنقية lyx لبروتين atypical PKC الداخلي والمؤتلف ونطاق ارتباط السيراميد النوعي الذي تم التعبير عنه في خلايا MDCK. تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية المبتكرة مقارنة بالطرق الحالية مثل Eliza أو مطيافية رنين البلازمونات مثل الارتباط السطحي، في أن التفاعل بين الليبيد والبروتين يتم تحقيقه في بيئة شبيهة بالغشاء، وبإمكان تنقية البروتينات المرتبطة وتحليلها. وتمتد تطبيقات هذه التقنية نحو علاج وتشخيص الأمراض التي تشمل الليبيدات، لأن التفاعل الفسيولوجي بين الليبيد والبروتين يكون مختلاً في هذه الأمراض.

بالنسبة لبعض هذه الأمراض، لا تكون البروتينات المستهدفة معروفة حتى وأنها تحتاج إلى تحديد. لتصميم علاج يعتمد على الدهون، ابدأ بتجهيز الحويصلات الدهنية الكبيرة (SLEs) من خليط مجفف من كميات متساوية المولات من phosphatidyl serine و C 16 ceramide في 100 µL من محلول sical المنظم. قم بإجراء عملية السونكة (sonication) لمدة ساعة واحدة بعد إضافة 300 µL من محلول sical المنظم، المدعم بـ 0.1 mM من manganese chloride. قم بفرز العينات باستخدام جهاز الطرد المركزي عند 12,000 ×g لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C، ثم أعد تعليق كتلة الحويصلات الدهنية الكبيرة في 100 µL من محلول sical المنظم. أضف 1 nM من صبغة vibrant cm DII الفلورية واحضن العينة عند درجة حرارة 37 °C لمدة ساعة واحدة لتسهيل رؤية جزء الـ SLE بعد الفصل المغناطيسي (max separation)، ثم استعد كتلة وردية من phosphatidyl serine و ceramide SLEs المصبوغة بـ vibrant cm dai عن طريق الطرد المركزي، وأعد تعليقها في 100 µL من محلول tris المنظم.

بعد ذلك، ولتحضير مستخلص خلوي خالٍ من المنظفات، يتم تعريض الخلايا للموجات فوق الصوتية في 300 µL من محلول منظم عالي التوتر يتكون من 10 mM tris، وكلوريد الهيدروجين، ويحتوي على مثبطات البروتياز والفوسفاتاز، ثم يتم إجراء الطرد المركزي. ولإزالة الحطام الغشائي، يتم الآن إضافة المستخلص الخلوي الرائق إلى المعلق الفيزيائي للدهون وتحضين الخليط لمدة ساعتين عند درجة حرارة 4 °C. ونظرًا لأن المستخلصات الخلوية قد تحتوي على أغشية داخلية بها phosphate aerin، يوصى بتنقية المستخلص من هذه الأغشية عبر خطوات إضافية من الطرد المركزي.

أضف إلى خليط التفاعل 20 µL من منظم ربط XNV و50 µL من محلول يحتوي على حبيبات مغناطيسية مقترنة بـ XNV، ثم حضن الخليط لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 4 °C، وأجرِ عملية فرز الخلايا المنشط مغناطيسياً وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. بعد ذلك، راقب فلورة vibrant CM DII في أجزاء التدفق والشوروف باستخدام قارئ فلورة الصفائح الدقيقة لتحديد وجود وكمية lipid les في مقايسة تنافس الأجسام المضادة. وللتحقق من خصوصية تفاعل ربط A PKC بحويصلات ceramide phospho Seine، حضن 1 µg من الجسم المضاد متعدد النسائل للأرانب anti P KC Zeta مع مستخلص خلوي لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 4 °C، يليه التحضين مع الحويصلات الدهنية.

استكمل تحليل SDS page واللطخة المناعية (immuno blotting) للبروتين المرتبط بسلاسل فوسفات سيرين سيراميد في المستخلص الأقصى لإعادة التكوين المختبري لمعقد قطبية البروتين الدهني؛ ابدأ بتحضير راسب وردي من حويصلات فوسفات سيرين سيراميد المصبوغة بـ vibrant cm DII كما هو موضح سابقاً، ثم أعد تعليق الحويصلات في 100 µL من محلول tri buffer، مضافاً إليه 100 µM من gamma S GTP و 1 mM من GDP، ومزيج من البروتينات المؤشبة ذات الصلة. بعد ذلك، حضّن التفاعل عند درجة حرارة 4 °C لمدة ثلاث ساعات. ثم أضف 5 µL من محلول مخزون بتركيز 20 x من X in V buffer و 50 µL من الخرز المغناطيسي المقترن بـ X in V.

قم بحضن الخليط تحت تقليب خفيف لمدة 30 دقيقة أخرى عند درجة حرارة 4 °C. استمر في إجراء عملية فرز الخلايا المنشط مغناطيسياً NX NV وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة لتسهيل عملية الترسيب. ثم قم بتدعيم جزء الشطف بـ 10 µg من e albumin النقي.

قم بتركيز البروتينات عن طريق الترسيب باستخدام طريقة weyl flue. تتكون المرحلة السفلية من الكلوروفورم والميثانول مع cm dii الغني والمتقلب. تحتوي المرحلة البينية البنية اللون على الحبيبات المغناطيسية والبروتينات المترسبة.

قم بقياس كمية حويصلات اللبيدات من خلال الكشف عن صبغة cm dii الوردية والزاهية في طور الكلوروفورم والميثانول العضوي لتفاعل weyl flu. استخدم كميات متساوية من حويصلات اللبيدات لتوحيد كميات البروتين بين العينات، ثم قم بالتحليل باستخدام SDS page واللطخة المناعية (Immuno blotting).

محلل خالٍ من المنظفات لخلايا MDCK التي تعبر عن البروتين PKC Zetta كامل الطول والمرتبط طرفياً ببروتين فلوري أخضر أو نطاق ارتباط السيراميد. تم تحضين الطرف الكربوكسيلي لـ PKC Zetta مع phospho seine.

تم تحليل البروتينات عن طريق اللطخة المناعية بعد استخلاص حويصلات السيراميد من عمود max. تم استرداد جزء ربط السيراميد C 20 Zeta، وEGFP، وبروتين P KC Zeta كامل الطول من الـ EIT لعمود max، وهو ما يتوافق مع خصوصية وفعالية إجراء lyx. أما التحكم السلبي EGFP، الذي لم يرتبط بالفوسفات في حويصلات السيراميد السورية لدينا، فلم يكن قابلاً للكشف في الـ eit.

عندما يتم استكمال تقنية Linx بطرق أخرى مثل SDS page واللطخة الغربية (western blotting) أو تحليل البروتوميات، يمكن الإجابة على أسئلة إضافية مثل تحديد البروتينات الموجودة في معقد البروتين المرتبط بالليبيدات. وبعد تطويرها، مهدت LabX الطريق للباحثين في مجال أبحاث الليبيدات الفردية لاستكشاف الموت الخلوي المبرمج المستحث بالسيراميد والقطبية الخلوية في الخلايا العصبية الجذعية والخلايا الظهارية.