السيليكون لمعالجة الرقائق خلية خلية التفاعل

مرحباً، أنا إليوت هو، زميل ما بعد الدكتوراه في مختبر تيا هنا في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا. سنقوم اليوم بتحضير مستنبتات خلوية على شرائح سيليكون ميكرو-ميكانيكية. تبدو هذه الأجهزة مثل أمشاط صغيرة تتشابك معاً، وهي تتيح لنا التحكم بدقة في التفاعلات بين مجموعتين مختلفتين من الخلايا.

سندرس اليوم التفاعل بين الخلايا الكبدية وخلايا السداة الداعمة. وتحديداً، يتم استزراع خلايا أرومات ليفية من نوع T3 على السطح العلوي للأمشاط، بحيث يمكنك تحريك الخلايا وتغيير ترتيبها المكاني عن طريق إزاحة أصابع المشط. ينقسم كل جهاز إلى جزأين يتم تركيبهما معاً في شكلين محتملين.

تؤدي الحالة الأولى إلى تلامس مجموعتي الخلايا مع بعضهما البعض. أما الحالة الثانية فتفصل بين المجموعتين قليلاً بحيث لا تستطيع الخلايا التلامس. وهنا، يتم منع التفاعلات القائمة على التلامس، بينما يتم الحفاظ على التفاعلات التي تتم عبر العوامل المفرزة.

لنبدأ بالحديث عن كيفية التعامل مع القطع باستخدام الملاقط. أفضل استخدام كل من ملاقط تيفلون الكبيرة وملاقط معدنية ذات طرف مستدير صغيرة. باستخدام الملاقط الكبيرة، يمكنك التقاط القطع من الحواف على هذا النحو؛ أما بالنسبة للقطع الأكبر ذات الأذرع، فيجب توخي الحذر لعدم كسر الأذرع لأنها هشة للغاية.

لذا، يجب التقاطها من الجهة الخلفية للجزء بهذا الشكل. وباستخدام الملاقط المعدنية، يمكنك الوصول إلى الثقب والتقاط الرقاقات مباشرة. ستناسب الأجزاء الأكبر جدار لوحة ذات 12 بئراً، بينما ستناسب الأجزاء الأصغر إما لوحة ذات 24 بئراً أو يمكن دمجها مع الجزء الأكبر.

في طبق يحتوي على 12 بئراً، عادةً ما أستخدم ملاقط معدنية. وعندما أتعامل مع الأجزاء الموجودة في الأطباق لتركيب جزأين معاً، أقوم عادةً بوضع الجزء الأكبر في البئر أولاً ودفعه تماماً إلى أحد الجانبين. بعد ذلك، آخذ قطعة الإصلاح المكملة وأضعها في الجانب الآخر من البئر، ثم أقوم بدفعهما معاً باستخدام ملقطين، بحيث يوضع ملقط واحد في كل فتحة.

والآن يمكنني ببساطة تثبيت الأجزاء معاً، إما في تكوين الفجوة أو في تكوين التلامس. وإذا أردت فصل الأجزاء، فإنني أفضل سحب الأجزاء إلى تكوين الفجوة ثم السحب عمودياً للأعلى لإزالة الجزء. وبما أن الأجهزة مصنوعة من السيليكون، فإنها تحتاج إلى أن يتم طلاؤها للسماح بالتصاق الخلايا بشكل صحيح.

من المرجح أن تستلم الأجهزة وهي مغلفة بالفعل بالبوليسترين ومعالجة بالبلازما، لذا سنفترض أن هذه هي نقطة البداية. أولاً، سنستخدم الكولاجين لطلاء السطح الذي ستلتصق به الخلايا الكبدية. سنضع أمشاط الخلايا الكبدية في محلول كولاجين بتركيز 50 µg/mL، ونحضنها عند 37 °C لمدة 45 دقيقة.

أما بالنسبة لأمشاط الخلايا الليفية (fibroblast combs)، فلا نحتاج إلى طلائها. بعد فترة التحضين، نقوم بشفط محلول الكولاجين والغسل بالماء. والآن سنقوم بإغلاق الـ ES معاً بحيث تتلامس الأجزاء المتكاملة لتشكيل سطح مستوٍ لزراعة الخلايا.

أولاً، سنقوم بملء بعض الآبار بـ 70% ethanol. سأضع زوجاً في كل بئر ثم أقوم بتثبيتهما معاً. وبعد التثبيت، نريد فحص الأجزاء تحت المجهر للتأكد من أنها متساوية المستوى.

قد تتعاشق الأجزاء أحياناً بشكل غير محاذٍ. وعند فحصها تحت المجهر، ستلاحظ أنها تقع في مستويين بؤريين مختلفين. في هذه الحالة، قم ببساطة بفصل الأجزاء ثم دفعها معاً مرة أخرى. وبعد التأكد من دقة المحاذاة، نترك الأجزاء في الإيثانول لفترة من الوقت لتعقيمها.

غالباً ما أكون في عجلة من أمري، لذا أكتفي بالنقع لمدة 10 دقائق. وبعد التعقيم، نحتاج إلى شطف المادة؛ نقوم بسحب الإيثانول تماماً والغسل بالماء، ثم السحب والغسل بالماء مرة أخرى، وأخيراً سحب الماء واستبداله بوسط الزرع الخاص بك.

لنقم الآن بزراعة الخلايا على الأجهزة. عادةً، نقوم بتعليق الخلايا بتركيز 500,000 خلية لكل milliliter، وننقل بواسطة الماصة 1 milliliter من المعلق فوق كل زوج من الأمشاط باستخدام طبق يحتوي على 12 بئراً. لذا، قمنا بزراعة الخلايا الليفية بتركيز 500,000 خلية لكل milliliter في اثنين من الآبار.

وبالمثل، أخذنا معلقاً يحتوي على 500,000 خلية كبدية لكل بئر وزرعناها في البئرين الآخرين. والآن، قبل التحضين، سنقوم برج الخلايا جيداً للتأكد من توزيعها بالتساوي. وأفضل الرج ثلاث مرات رأسياً، وثلاث مرات أفقياً، ثم تكرار هذه العملية ثلاث مرات.

بعد الرج، سنقوم بوضعها في الحاضنة ونترك الخلايا لمدة 15 دقيقة، وعند هذه النقطة سنقوم برجها مرة أخرى. وبعد الرج كل 15 دقيقة لمدة ساعة واحدة، سنقوم بعد ذلك بشفط معلق الخلايا ووضع معلق خلايا جديد. وسنكرر هذه العملية حتى نحصل على طبقة متلاحمة من الخلايا.

عادةً ما يتطلب الأمر جلسة زراعة واحدة أو اثنتين مع الخلايا الليفية (fibroblasts)، بينما قد يتطلب الأمر من جلستين إلى أربع جلسات مع الخلايا الكبدية (hepatocytes). وللحصول على طبقة أحادية متلاصقة، يتم زرع الخلايا بكثافة عالية نسبياً، ويضمن الرج توزيع الخلايا بشكل متساوٍ.

بعد عملية الاستزراع الأولى، تتشكل طبقة رقيقة من الخلايا. نلاحظ أن الخلايا تلتصق فقط بالأصابع التي تم طلاؤها بالبوليسترين والكولاجين. وبعد استزراع خلايا جديدة والحضانة لمدة ساعة أخرى، مع الرج مرة أخرى كل 15 دقيقة، تزداد كثافة طبقة الخلايا.

بعد عملية الاستزراع الثالثة، نحصل على كثافة خلوية جيدة، ويمكننا الآن التوقف بمجرد استزراع الخلايا على الأمشاط. نريد الآن توجيه الخلايا إلى التكوين التجريبي المطلوب. يتم الآن فصل الأجهزة عن أجزائها المكملة وتحضينها لمدة 24 ساعة.

بعد مرور 24 ساعة، تكون الخلايا قد انتشرت لتشكل طبقة أحادية متصلة فوق سطح الأمشاط. والآن، نرغب في إنشاء زراعة مشتركة؛ حيث يتم نقل مشط الخلايا الكبدية وممشط الخلايا الليفية إلى نفس البئر وإغلاقهما معاً وفقاً للتشكيل الأولي المطلوب.

عند الرغبة. بعد مرور فترة زمنية معينة، يمكنك تغيير التشكيل. على سبيل المثال، يمكننا الانتقال إلى تشكيل الفجوة بعد 18 ساعة، حيث يتم وضع الأجزاء في نفس الوضع، وتُدفع معاً بقوة حتى يتم الوصول إلى تشكيل الفجوة، ثم تُدفع للتلامس مرة أخرى وصولاً إلى تشكيل الفجوة.

سنقوم الآن بإزالة مشط واحد. ما سنفعله الآن هو المرور بعملية إزالة طبقة البوليسترين القديمة، وتنظيف الرقاقات، ثم وضع طبقة بوليسترين جديدة وتجهيزها لزراعة الخلايا. ومرة أخرى، من خلال إزالة طبقة البوليسترين القديمة ووضع طبقة جديدة، نضمن عدم تداخل أي آثار من التجربة السابقة مع التجربة الجديدة.

بعد الانتهاء من التجربة، أول خطوة يجب القيام بها هي تبييض الخلايا، ثم شطف الأمشاط بالماء. وقبل وضع الرقائق في جهاز التولينج، يجب التأكد من جفافها تماماً. لدينا هنا بعض الأمشاط التي تركتها لتجف في الهواء لفترة، وأقوم الآن بالتأكد من أنها جافة تماماً.

والآن سنقوم بأخذ بعض التولوين ووضعه في هذا الوعاء الزجاجي. سنستخدم ماصة زجاجية هنا حتى لا نذيبها؛ حيث إن التولوين يذيب البلاستيك، لذا لا يمكننا استخدام الماصات التقليدية المصنوعة من البوليسترين.

حسنًا، هذا يكفي تقريبًا. والآن سنأخذ بعضًا من هذه الأجزاء، ونضعها في التولوين، وسأقوم بتشغيل الهزاز للرج، وسنغطيها بورق ألومنيوم لمنع تبخر التولوين. فبعد مرور ساعتين، يفترض أن يكون التولوين قد أذاب معظم البوليسترين الموجود على الأمشاط، وعندها يمكننا ببساطة إخراجها وترك الأمشاط لتجف في الهواء.

بعد عملية الشطف بـ Halloween، يجب أن تكون الأجزاء خالية نسبياً من البوليسترين ونظيفة إلى حد ما. ومع ذلك، نحتاج إلى أن تكون الأجزاء نظيفة للغاية لضمان تكوين التصاق جيد لطبقة البوليسترين الجديدة؛ فإذا لم تكن نظيفة للغاية، يميل البوليسترين إلى التقشر في منتصف التجربة عندما تبدأ الخلايا في سحبه.

سنقوم الآن بعملية تنظيف باستخدام حمض البيرانا. لقد وضعت القطع في وعاء زجاجي وسنقوم بتسخينها، لذا سنضع الوعاء على لوح تسخين.

وهنا لدينا حمض الكبريتيك وبيروكسيد الهيدروجين. سأقوم بسكب حمض الكبريتيك أولاً، وهنا، تأكد من أن جميع الرقائق مغمورة تحت السائل، ففي بعض الأحيان تميل هذه الرقائق إلى الطفو.

وبما أننا نتعامل الآن مع مواد كيميائية تسبب التآكل بشكل كبير، تأكد من ارتداء معدات الوقاية المناسبة. أنا هنا أرتدي قفازات النيتريل. سنقوم الآن بسكب بيروكسيد الهيدروجين في الحمض، ويجب توخي الحذر هنا لأن هذا التفاعل طارد للحرارة.

كما تلاحظون، هناك تصاعد طفيف للدخان أثناء التفاعل، ولكننا نرغب في إضافة بعض الطاقة إلى النظام لزيادة نشاطه التفاعلي. لذا، سنقوم الآن بتسخينه حتى 120 °C، وهي درجة الحرارة الحالية تقريباً، وبذلك يمكنك التأكد من إزالة جميع بقايا المزرعة الخلوية تماماً من الرقائق. وفي هذه المرحلة، عليك ترك التفاعل يستمر حتى يكتمل استهلاك جميع بيروكسيد الهيدروجين.

وعند هذه النقطة، سيتوقف المزيج عن إخراج الفقاعات. لذا، يستغرق التفاعل حوالي نصف ساعة ليكتمل مساره. وبعد أن تتوقف عن رؤية الفقاعات، يمكنك ببساطة إيقاف تشغيل السخان وترك المزيج ليبرد.

وسنقوم بنقلها إلى ماء منقّى. ومرة أخرى، تأكد من استخدام ملاقط تيفلون هنا، وليس ملاقط معدنية، ويمكنك ببساطة التقاطها ونقلها. والآن سنقوم بشطفها تحت تدفق مستمر من DDH₂O. عادةً ما آخذها مباشرة من الصنبور، وسنتركها تتدفق لمدة 10 دقائق على الأقل هنا.

وبذلك، سنقوم بغسل جميع آثار الحمض بعد التقطيع تحت تدفق مائي لمدة 10 دقائق. يجب إزالة الحمض من الرقائق، وسوف نقوم بتخزينها تحت الماء حتى يحين وقت طلاء البوليسترين، وهو بوليسترين بوزن جزيئي 45,000 حصلنا عليه من Sigma. وسنقوم بوزن كمية صغيرة منه هنا.

لدينا 400 ملليجرام وسنقوم بإذابتها في التولوين بتركيز 100 ملليجرام لكل ملليليتر. لذا يجب التعامل مع التولوين داخل غطاء السحب الكيميائي (الشفاط). والأمر الآخر هو أنه نظراً لأننا سنستخدم التولوين لإذابة البوليسترين، فيجب التأكد من عدم استخدام أي أدوات مختبرية مصنوعة من البوليسترين.

نستخدم هنا أنبوب بولي بروبيلين مخروطي وماصة زجاجية. وبما أن لدي 400 milligrams من البوليسترين، سأضيف أربعة milliliters من التولوين. والآن سنقوم برجّه باستخدام جهاز الفورتكس لمدة نصف ساعة حتى يذوب البوليسترين. لذا سنقوم الآن برج الأنبوب باستخدام جهاز الفورتكس بأقل سرعة لمدة تتراوح بين 20 دقيقة إلى نصف ساعة.

سأقوم بتثبيت الأنبوب على جهاز الرج (vortex). ليس من الضروري الإمساك به طوال الوقت. بعد مرور 20 إلى 30 دقيقة، يجب أن يكون البوليسترين قد ذاب، ونصبح مستعدين لعملية التغليف.

سنقوم الآن بطلاء البوليستيرين باستخدام الطلاء الدوراني في منشأتنا. يوجد جهاز الطلاء الدوراني الخاص بنا في غرفة نظيفة، لذا يتعين علينا هنا ارتداء غطاء للرأس، ونظارات واقية، ورداء مختبر، وأغطية للأحذية، وقفازات، ولكن قد تختلف هذه المتطلبات في منشأتكم.

قبل استخدام هذا الملقط، أريد حمايته من البوليسترين. لذا، سنقوم بتغطيته بورق الألومنيوم، ونريد جعله مسطحاً قدر الإمكان على السطح بحيث تستقر الشريحة بشكل مستوٍ تماماً مقابل السطح. سنقوم بعمل ثقب صغير في المنتصف تماماً لنتمكن من الحفاظ على تفريغ الهواء على الشريحة.

يتم ضبط جهاز الطرد المركزي الدوار على 2,400 RPM ولمدة 30 ثانية. الآن يمكننا أخذ إحدى الرقاقات، ووضعها بحيث يغطي مركز الرقاقة الفتحة، وسأقوم بإبقاء جهاز الشفط مطفأً في البداية عند وضع البوليسترين، ثم أقوم بتشغيل جهاز الشفط، وبعد ذلك أبدأ عملية الدوران. وبالنسبة للأجزاء الأصغر، يمكننا وضع أقل من 10 قطرات.

وبالنسبة للأجزاء الأكبر، يتطلب الأمر ما يزيد قليلاً عن 10 قطرات من polystyrene. وسنقوم بتدويرها لمدة 30 ثانية بسرعة 2,400 RPM. والآن سنأخذ الرقائق المغلفة بـ polystyrene ونضعها في الفرن عند 120 °C، وهي درجة حرارة أعلى من نقطة الانتقال الزجاجي لـ polystyrene.

وبذلك سيعيد صهر السطح لتنعيمه قليلاً، كما سيؤدي ذلك إلى زيادة كثافة البلاستيك وتصلبه. لذا، عادةً ما أتركه في الفرن طوال الليل، إذ تستغرق هذه العملية بضع ساعات على الأقل حتى تكتمل.

بعد عملية الخبز طوال الليل، تصبح الرقائق جاهزة للمعالجة بالبلازما. والآن سنعرض البوليسترين لبلازما الأكسجين، وهو ما سيغير طاقة السطح بحيث تلتصق البروتينات والخلايا به بشكل أفضل. لذا، سنقوم ببساطة بتحميل الرقائق في غرفة البلازما وتفريغها للوصول إلى حالة الفراغ.

يعد استخدام إعداد 200 mil من الفراغ وقدرة 200 watts لمدة دقيقة واحدة تحت تدفق غاز الأكسجين خياراً جيداً. والآن بعد تفريغ النظام، سنقوم بإدخال الأكسجين. حسناً، يمكننا الآن تشغيل قدرة RF، وبدء تفريغ البلازما لمدة دقيقة واحدة.

لذلك، عندما تعمل البلازما، فإنها تتوهج بالفعل، تماماً مثل مصابيح الفلورسنت. وبعد دقيقة واحدة من التعرض للبلازما، سنعيد الضغط إلى المستوى الجوي ثم نتمكن من إخراج القطع.

الآن أصبحت الأجزاء جاهزة لطلاء البروتين وتغذية الخلايا. كان الهدف من تصميم هذا الجهاز هو تمكيننا من التحكم في البنية الدقيقة للأنسجة بطريقة ديناميكية. لذا فإن التنظيم الدقيق للأنسجة في الجسم، وتحديداً مواقع الخلايا بالنسبة لبعضها البعض، أمر بالغ الأهمية في تحديد وظيفة كل خلية معينة في المزرعة المختبرية.

حتى وقت قريب، لم نكن قادرين على محاكاة ذلك بشكل جيد، ولكن على مدى السنوات الخمس أو العشر الماضية، بدأ الباحثون في القدرة على تشكيل أنماط مجهرية للخلايا فوق ركيزة زراعة الأنسجة، وبذلك يتم وضع الخلايا بالضبط في المواقع التي نريدها داخل طبق زراعة الأنسجة. ومن خلال القيام بذلك، تمكنا من اكتشاف بعض الجوانب الهامة في البيولوجيا الأساسية للتفاعلات بين الخلايا على المقياس المجهري. أما ما لم نكن قادرين على فعله حتى هذه اللحظة فهو تنفيذ ذلك بشكل ديناميكي.

وهذا يعني تغيير تنظيم المزرعة الخلوية في منتصف التجربة. وهذا أمر مهم لأن الأنسجة في الجسم لا تمثل بيئة ثابتة في الواقع؛ إذ لدينا خلايا تتحرك وتعيد تنظيم نفسها، لا سيما في عمليات التئام الجروح أو النمو التطوري.

ولكن حتى في عضو طبيعي في حالة توازن داخلي، هناك الكثير من العناصر التي تتحرك. إن الجانب التقني الأكثر صعوبة في التعلم هو كيفية التعامل المادي مع الأجزاء. وفي البداية، عند البدء في العمل على هذا النظام، قد تشعر بالرهبة من مدى هشاشة الأجزاء أو مدى دقة الحركات التي يتعين عليك القيام بها.

لكنني أعتقد أنك إذا تدربت على استخدامه لفترة وجيزة، فلن تواجه الكثير من الصعوبات. هناك بعض الحالات التي يكون لهذا الجهاز فيها دور، فعلى سبيل المثال، في التطور الجنيني، تلامس الخلايا سلسلة من البيئات الخلوية المختلفة أثناء تبرعمها عبر الطبقات الجنينية المتنوعة. ومن المعروف أن التفاعلات مع كل طبقة من هذه الطبقات عند تلامسها بالتتابع، تدفع الخلايا جميعاً إلى الأمام ضمن مسار تمايز محدد.

وبناءً على ذلك، نعتقد أن هذا النوع من الأجهزة قد يكون مناسباً لمحاولة محاكاة هذا النوع من الأحداث في المختبر. ومن الجوانب التي رغبنا بشكل خاص في دراستها في التنظيم الدقيق هو الفرق بين تواصل الخلايا عبر التفاعلات التلامسية حيث تتلامس أغشية الخلايا مع بعضها البعض، مقابل العوامل الذائبة التي تُفرز في الوسط المحيط وتنتشر لتصل إلى خلية تبعد مسافة أبعد قليلاً. وفي كثير من الأحيان، عندما تكون الخلايا في زراعة مشتركة ويكون لها تأثير متبادل، لم يكن من الواضح ما إذا كانت هذه التفاعلات تلامسية أو عوامل مُفرزة هي التي تؤدي هذا الدور.