الزخرفة من الخلايا الجذعية الجنينية باستخدام رقاقة بيو فليب
أكتوبر 1, 2007
نحن يبرهن على وجود طريقة بسيطة لوضع الخلايا في الأماكن المطلوبة على ركيزة. هذا الأسلوب أنماط الخلايا بواسطة رقاقة السيليكون التقليب microwells تحتوي على خلايا مملوءة الركيزة. هذا الأسلوب يوفر طريقة جديدة لتعديل الإشارات وإنتشاري juxtacrine بين الخلايا.
أنا نيكيل ميتال، طالبة دراسات عليا في مختبر بومان. سأتحدث اليوم عن جهاز طوره طالبان سابقان في مختبرنا، ويسمى bio flip chip.
ويتيح هذا الجهاز تقديم الخلايا على ركيزة يختارها الباحث ووفقاً للتكوين الذي يحدده. لذا فإن الجهاز نفسه، ولدينا واحد منه هنا، بسيط للغاية؛ فهو يتكون أساساً من آبار صغيرة في قطعة من السيليكون.
عادةً ما يتم تصميم كل بئر لاستيعاب خلية واحدة فقط، ولكن يمكننا بالطبع جعلها أكبر إذا لزم الأمر. وقد تمت عملية تصنيع الجهاز بحيث تكون الآبار في نفس الترتيب الذي ستستقر فيه الخلايا في النهاية على الركيزة. لذا، يتم تصنيع الجهاز نفسه باستخدام تقنيات الليثوغرافيا الرخوة.
على وجه الخصوص، نستخدم PDMS، وهو بولي ديميثيل سيلوكسان، ونقوم بتشكيله باستخدام قالب من رقاقة سيليكون. لدينا إحداها هنا. لذا، يتم تصنيع رقاقة القالب نفسها باستخدام تقنية الليثوغرافيا الضوئية القياسية لتشكيل نمط من مادة SUA المقاومة للضوء، والتي يتم طلاؤها دورانيًا على رقاقة السيليكون.
وباختصار، يتم نقل الخلايا إلى الركيزة المختارة عن طريق ملء آبار شريحة Bio Flip Chip بهذه الخلايا. بعد ذلك، يتم وضع الشريحة فوق الركيزة المختارة، والتي غالباً ما تكون من البوليسترين المخصص لزراعة الأنسجة. وأخيراً، يتم قلب المزيج مما يسمح للخلايا بالسقوط من الآبار والاستقرار على الركيزة.
أنا ستيفاني فلافين، باحثة في مرحلة البكالوريوس هنا في مختبر جولدمان، وسأقوم اليوم بشرح كيفية استخدام شريحة bio flip chip لتوزيع الخلايا بنمط معين في اليوم السابق. نريد إجراء تجربة لتوزيع الخلايا بنمط محدد.
سنقوم بربط PDMS بشريحة زجاجية مقاس بوصة واحدة في بوصة واحدة باستخدام البلازما. ثم نغمر الشريحة طوال الليل، بحيث يكون جانب الآبار لأسفل، في محلول PBS. سنقوم أيضاً بقص الحشوات التي ستُستخدم في تجربة التشكيل، ونجهز مشابك الربط التي سيتم استخدامها أيضاً.
ضع 200 µL من BSA على سطح كل شريحة. قم بهز سطح الشريحة باستخدام طرف الماصة لإزالة الفقاعات والسماح لمحلول BSA بملء الآبار. اترك الشرائح تحت غطاء التدفق الصفحي لمدة ساعة واحدة في ممر الضوء فوق البنفسجي (UV) كالمعتاد.
بعد مرور ساعة واحدة، قم بشفط محلول BSA من الرقاقات واغسل كل رقاقة بـ 200 microliters من PBS، ثم ضع 200 microliters من محلول الخلايا الممررة بكثافة 10 to the six cells per mil. بعد الانتظار لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق حتى تستقر الخلايا في الآبار، اشطف سطح الرقاقة باستخدام PBS. أمل الرقاقة نحو أحد الزوايا بزاوية 15 degree تقريبًا، ثم اسحب محلول الخلايا ببطء باستخدام الماصة من الزاوية السفلية للرقاقة.
أعد الشريحة إلى الوضع الأفقي وأضف ببطء 50 µL من PBS إلى الزاوية العلوية. كرر خطوة الغسل عدة مرات حسب الضرورة. وبمجرد غسل xls من سطح الشريحة، أضف ما يقرب من 50 µL من الوسط الزرعي إلى الحشية الداخلية للطبق.
أضف الوسط الغذائي إلى الجزء العلوي من كل شريحة. بعد ذلك، اقلب الطبق وقم بإمالته وتنزيله على سطح الشريحة، بدءاً من أحد الزوايا. ثم قم بتسطيح الطبق فوق الشريحة لتجنب تكون فقاعات بين الطبق والشريحة.
أضف مشابك تثبيت إلى كل جانب من الشريحة لتثبيتها في مكانها. وقم بإزالة المقابض من كل مشبك تثبيت بحيث عندما يتم قلب الشريحة، تستقر بشكل مستوٍ على الطبق، ثم انقل الشريحة إلى الحاضنة واقلبها بسرعة، مع تجنب جميع الحركات غير الضرورية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة طريقة مستحدثة لتحديد مواضع الخلايا على ركيزة باستخدام جهاز يسمى bio flip chip. ومن خلال قلب شريحة سيليكون تحتوي على آبار مجهرية ممتلئة بالخلايا فوق الركيزة، يمكن للباحثين التحكم بفعالية في توزيع الخلايا، مما يعزز تعديل إشارات التواصل بين الخلايا.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- بيولوجيا الخلية
- علم الأعصاب
- الهندسة الحيوية
خلفية علمية
- يُعد تحديد موقع الخلايا أمراً بالغ الأهمية لدراسة التفاعلات الخلوية.
- قد تفتقر الطرق الحالية إلى الدقة في وضع الخلايا.
- توفر شريحة القلب الحيوي (bio flip chip) حلاً بسيطاً وفعالاً.
- يمكن لهذه التقنية أن تؤثر على كل من الإشارات القابلة للانتشار والإشارات المجاورة (juxtacrine signaling).
الغرض من الدراسة
- تطوير طريقة موثوقة لوضع الخلايا على الركائز.
- تعزيز فهم آليات إرسال الإشارات الخلوية.
- توفير أداة للباحثين في مختلف المجالات البيولوجية.
الطرق المستخدمة
- تصميم وتصنيع الرقاقة الحيوية القلابة.
- ملء الآبار الدقيقة بالخلايا.
- قلب الرقاقة على الركيزة المطلوبة.
- مراقبة وتحليل توزيع الخلايا وإشاراتها.
النتائج الرئيسية
- النجاح في وضع الخلايا في المواقع المستهدفة.
- تحسين تعديل إشارات الخلايا.
- إثبات سهولة استخدام الجهاز.
- التطبيقات المحتملة في مختلف الإعدادات التجريبية.
الاستنتاجات
- تعد شريحة القلْب الحيوية (bio flip chip) أداة مبتكرة لوضع الخلايا.
- يمكن لهذه الطريقة أن تؤثر بشكل كبير على دراسات التأشير الخلوي.
- يمكن للأبحاث المستقبلية التوسع في هذه التقنية من أجل تطبيقات أوسع.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في القطاع الصناعي
يتيح التحكم المكاني الدقيق في المجموعات الخلوية الاستقصاء الميكانيكي لمسارات الإشارات القابلة للانتشار والإشارات المتاخمة (juxtacrine) الضرورية للتحقق من الأهداف في نماذج الأمراض القائمة على الخلايا الجذعية. توفر تقنية Bio Flip Chip طريقة غير مرتبطة بنوع الركيزة وتحافظ على الخصائص الكيميائية لنمذجة بيئات خلوية دقيقة ومحددة، مما يدعم تطوير مقايسات قابلة للتكرار للفحص المظهري. يعزز هذا النهج من الثقة التنبؤية في مراحل الاكتشاف المبكرة عن طريق تقليل التباين في التلامس الخلوي-الخلوي والتعرض للعوامل المجاورة (paracrine)، مما يؤدي إلى تحسين الاستمرارية الانتقالية من النماذج المختبرية (in vitro) إلى التحقق قبل السريري.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح اختبار الفرضيات المتعلقة بكيفية تأثير كثافة الخلايا الموضعية والترتيب المكاني على مسارات تمايز الخلايا الجذعية وتجديدها الذاتي.
- القيمة التشغيلية: تمنع التباين العشوائي الناتج عن الاستزراع العشوائي، مما يضمن مدخلات إشارات جيوكرينية وباراكرينية متسقة عبر المكررات.
- القيمة التنبؤية: تدعم الحد من المخاطر الميكانيكية من خلال عزل مساهمة الإشارات المعتمدة على التلامس مقابل الإشارات القابلة للذوبان في دراسات الارتباط بالهدف.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: توليد مصفوفات خلوية قابلة للقياس ومحددة مكانيًا، تتوافق مع التصوير عالي المحتوى والقراءات المتعددة (multiplexed readouts).
- القيمة التشغيلية: تتيح توحيد مقاييس التفاعل بين الخلايا عبر البوليسترين المستخدم في زراعة الأنسجة، والزجاج، والـ Matrigel، وطبقات الخلايا المغذية (feeder layers) دون تغيير كيمياء الركيزة.
- القابلية للتوسع: تتوافق مع الطباعة بالاتصال الدقيق (microcontact printing) لإنشاء أنماط من المصفوفة خارج الخلية، مما يسمح بالتحكم التوليفي في إشارات الالتصاق والتأشير.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الترجمية: نمذجة الخلايا الجذعية الجنينية في منافذ محددة لمحاكاة مسارات الإشارات التطورية ذات الصلة بالاضطرابات الخلقية والطب التجديدي.
- النمذجة قبل السريرية: تسهيل تحليل الاستجابة للجرعة للمورفوجينات أو العلاجات في بيئات مجهرية محكومة مكانياً، مما يعزز الملاءمة الفسيولوجية.
- التقدم المعدل حسب المخاطر: تقليل النتائج الإيجابية الكاذبة في تحديد المركبات الرائدة من خلال الحد من الضجيج الناتج عن تكتل الخلايا غير المنضبط أو تباين تكرار التلامس.
تكامل سير العمل والمسارات التحليلية
يُدمج Bio Flip Chip في سير عمل الاكتشافات المبكرة من خلال تمكين التنميط القابل للتكرار للخلايا الجذعية قبل التعرض للمركبات، مما يدعم الفحص القائم على الفرضيات والمتابعة الميكانيكية في تحسين الرصاصات.
- بيولوجيا الاكتشاف: اختبار كيف يقوم التنظيم المكاني المحدد للخلايا الجذعية الجنينية بتعديل تحديد السلالة ونشاط المسارات.
- الفحص: توفير ركائز خلوية معيارية وقابلة للتكرار لتقييم تأثيرات المركبات على الإشارات المعتمدة على التلامس والإشارات القابلة للانتشار.
- التحليلات: تمكين الرسم الخرائطي المكاني الكمي للتعبير عن المؤشرات، والتكاثر، والموت الخلوي المبرمج كمتغيرات تابعة في المزارع المشتركة المنقوشة.
- الأبحاث الانتقالية: نمذجة شلالات إشارات النمو البشرية في أنظمة محكومة مكانياً لتوجيه عملية اختيار الأهداف في المرحلة قبل السريرية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تعمل كمنصة نقش نمطية قابلة للتكيف مع أنواع خلايا وركائز وتكوينات مصفوفة خارج خلوية متعددة عبر المشاريع المختلفة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: زيادة الثقة في التحقق من صحة الهدف من خلال تقليل الضوضاء البيولوجية الناتجة عن التفاعلات غير المنضبطة بين الخلايا.
- القيمة التشغيلية: ضمان تكرارية المقايسة من خلال وضع الخلايا بدقة وفقاً لتحديد المستخدم، وبمعزل عن تباين تقنيات الاستزراع.
- القيمة الاستراتيجية: تحسين كفاءة اتخاذ قرارات المتابعة أو التوقف من خلال تعزيز نسبة الإشارة إلى الضوضاء في عمليات الفحص المظهري التي تستهدف التواصل بين الخلايا.
- التأثير على المحفظة: دعم ترتيب الأولويات المعدلة حسب المخاطر للمعدلات الخاصة بمسارات التواصل الملاصق (مثل Notch وWnt) في المجالات المرضية التي تتوسطها الخلايا الجذعية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في الطباعة الحجرية اللينة والتعامل مع PDMS لتصنيع الرقاقة أو تأمينها.
- يعتمد على إمكانية الوصول إلى معدات الربط بالبلازما والمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية/الأوزون لتحضير الركيزة.
- يستلزم بروتوكولات موحدة لتحضير الخلايا وغسلها لضمان كفاءة تحميل الآبار وتحريرها.
- قد يتطلب التكيف مع المصفوفات ثلاثية الأبعاد أو الأنظمة الموائعية الدقيقة تحسين توقيت القلب وطاقة السطح.
- قيد عملي: يجب تحديد نسبة إشغال الآبار تجريبياً لكل نوع وحجم من الخلايا لتجنب تحميل خلايا متعددة في الآبار المصممة لخلية واحدة.
