يعيش التصوير من النتوء خلية من البشرة من اسماك الزرد النامية

تتطلب صيانة الأنسجة الطلائية إزالة مستمرة للخلايا التالفة والميتة دون تعطيل وظيفة الحاجز. ولتحقيق ذلك، تقوم الخلايا الطلائية بطرد الخلايا الميتة عن طريق تكوين وتقليص حلقة من الأكتين والميوسين في الخلايا المحيطة بالخلية الميتة لإخراجها مع إغلاق أي فجوات قد تنتج عن خروجها. يقدم هذا المقال المرئي طريقة لتحفيز وتصوير طرد الخلايا المبرمج من بشرة يرقات سمك الزيبرا في الوقت الفعلي.

يتم تحقيق ذلك، كما هو موضح، عن طريق حقن مسبار F actin المسمى ببروتين فلوري أحمر في مرحلة خلية واحدة من أجنة سمك الزرد المعدلة وراثياً والتي تعبر عن بروتين فلوري أخضر في البشرة، وذلك لتصور خيوط الأكتين في الأنسجة الطلائية. بعد ذلك، تُعالج اليرقات في اليوم الرابع بعد الإخصاب والتي تعبر عن كل من GFP و RFP باستخدام G418 لتحفيز الموت الخلوي المبرمج في البشرة. ويتم تصور ديناميكيات الأكتين وتغيرات شكل الخلايا الطلائية التي تحدث أثناء عملية البثق عن طريق التصوير بفاصل زمني باستخدام مجهر كونفوكالي ذو قرص دوار.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل تحليلات القوة المناعية، في قدرتنا على ملاحظة التغيرات السريعة وديناميكيات الأكتين التي تحدث أثناء عملية البثق في نسيج ظهاري حي. سنعرض لكم في هذا الفيديو إجراءً لتصوير بثق الخلايا المبرمج موتها من بشرة أسماك الزيبرا النامية في الوقت الحقيقي. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لفهم كيفية إعادة ترتيب الخلايا لهيكلها الخلوي من الأكتين بشكل منسق لإزالة الخلايا المبرمج موتها مع الحفاظ على وظيفة الحاجز، وكيف يمكن أن يؤدي تعطيل عملية البثق إلى حالات مرضية معينة.

لنبدأ الآن؛ لتصور ديناميكيات الأكتين أثناء عملية البثق الخلوي في بشرة أسماك zebrafish النامية، ابدأ بإذابة RNA المنسوخ مسبقاً على الثلج. نقوم بنسخ mRNA المشفر للبروتين الفلوري الأحمر المندمج مع نطاق التماثل لـ calp في utrophin والبروتين الرابط للأكتين. أضف phenol red إلى RNA بنسبة 1:1 ليصل التركيز النهائي لـ RNA إلى حوالي 30 ng/µL، ثم قم بتعبئة 1 µL من المحلول في إبرة شعيرية مسحوبة عن طريق التعبئة الخلفية.

اجمع حوالي 75 جنينًا من سلالة C-K-G-F-P في المرحلة الخلية الواحدة في محلول E three المنظم. انقل الأجنة المجموعة إلى قالب الحقن المجهري باستخدام ماصة باستور سعة 5.75 مل، وقم بتوجيه الأجنة برفق في المجرى باستخدام ملقط Dumont رقم 5. اعمل بسرعة لتجنب الاضطرار إلى حقن الـ RNA في أجنة في مراحل نمو متعددة تحت مجهر تشريحي ستيريو مختبري قياسي.

استخدم محقنًا دقيقًا يتم التحكم فيه بالضغط لحقن الـ RNA في مح يرقات الأجنة كعلامة فينولية. يجب أن يكون اللون الأحمر مرئيًا في الجنين بعد الحقن. تأكد من حقن 50 جنينًا على الأقل لكل تجربة.

قم بفرز الأجنة لإزالة أي بيوض غير مخصبة أو تالفة، ثم حضن جميع الأجنة المتبقية عند درجة حرارة 28 درجة Celsius. وبعد مرور 24 ساعة، استخدم مجهر تشريح فلوري لاختيار أجنة zebrafish التي تظهر مستوى عالٍ من فلورة GFP في البشرة وفلورة RFP المحددة. حضن الأجنة المختارة عند درجة حرارة 28 درجة Celsius حتى تصبح جاهزة للبدء في المعالجة الدوائية لتحفيز الموت الخلوي المبرمج عن طريق التعريض لمادة amino glycoside.

يؤدي المضاد الحيوي G 418 أو الدواء إلى دفع الخلايا المبرمج موتها للخارج من بشرة يرقات zebrafish النامية. ومن المهم ملاحظة أن هذه المعالجة تعمل فقط على اليرقات التي بلغ عمرها أربعة أيام بعد الإخصاب أو أكثر لتحفيز خروج الخلايا. اجمع ما يصل إلى 25 من يرقات zebrafish في اليوم الرابع بعد الإخصاب والتي تعبر عن كل من GFP و RFP في طبق زراعة مقاس 35 × 10 مليمتر يحتوي على ثلاثة مليلتر من وسط E3.

استبدل الوسط بعناية بثلاثة ملليلتر من E three الذي يحتوي على 1 mg/mL من G four 18، ثم حضّن اليرقات في العقار لمدة أربع ساعات في الظلام عند 28 °C. بعد ذلك، قم بإزالة الوسط واستبداله بوسط E three مُدفأ مسبقاً يحتوي على 0.02% trica، ثم انتقل إلى تثبيت اليرقات من أجل التصوير. انقل ما يصل إلى ثلاث يرقات إلى أنبوب fendor سعة 1.5 ملليلتر وقم بإزالة معظم وسط E three.

باستخدام رأس ماصة مقصوص، انقل 120 µL من محلول low melt aros بتركيز 1% إلى الأنبوب ثم اخلطهما. بعد ذلك، انقل اليرقات ومزيج aros برفق بواسطة الماصة إلى شريحة غطاء موجودة في قاع طبق زراعة matech. وباستخدام حامل دبابيس FST مزود بدبوس إدخال أو إبرة تنجستن مثبتة، قم بتوجيه اليرقات بسرعة بحيث تكون مستقيمة ومسطحة تماماً مقابل شريحة الغطاء.

اترك agarose ليتصلب. بعد ذلك، املأ الطبق برفق بوسط E three الذي يحتوي على 0.02% trica. لقد وجدنا أن العملية الكاملة لطرد الخلايا المبرمج (apoptotic cell extrusion) من بشرة يرقات zebrafish النامية تستغرق حوالي 20 دقيقة.

نوضح هنا كيفية إعداد تجربة تصوير بالفاصل الزمني باستخدام مجهر كونفوكال ذو القرص الدوار وبرنامج and or IQ لجمع سلسلة من المستويات Z عبر طبقة واحدة من بشرة سمكة الزيبرا. أولاً، قم بتشغيل ليزرات الأرجون والهيليوم-نيون وكاميرا المجهر ومصباح الفلورسنت فوق البنفسجي ضمن برنامج and or IQ. ثم أنشئ بروتوكولاً للسلسلة الزمنية يتضمن الأطوال الموجية المراد تصويرها.

تردد الفواصل الزمنية بين عمليات التقاط الصور وعدد مرات تكرار الالتقاط. ضع طبق mattec الذي يحتوي على العينة برفق على منصة المجهر، ثم استخدم عدسة شيئية بقوة تكبير 20 مرة مع الضوء النافذ لتركيز الرؤية على اليرقات. حرك العدسة الشيئية الغمر المائية بقوة تكبير 40 مرة إلى الموضع الصحيح. وباستخدام هذه العدسة، يمكننا تصوير ما يقرب من 20 إلى 25 خلية في كل حقل رؤية، مما يتيح لنا تتبع السلوكيات الخلوية أثناء عملية البثق، مع إمكانية تحليل ديناميكيات الأكتين داخل الخلية في الوقت ذاته.

ضع قطرة من الماء بعناية على الجزء العلوي من العدسة الشيئية بقوة 40x، ثم ضع طبق mattec بسرعة فوقها. حدد العينة باستخدام إضاءة المجال الساطع (brightfield)، ثم استخدم الفلورية فوق البؤرية (epi fluorescence) بطول موجي 488 nanometer للتركيز تحديداً على البشرة الموجبة لـ GFP. انتقل إلى وضع المسح البؤري (confocal scanning mode).

قم بتعديل شدة الليزر ووقت التعريض لكل قناة وفقاً لذلك. احرص على موازنة قدرة الليزر ووقت التعريض لتحقيق الكشف الأمثل عن الإشارة ومنع حدوث أي سمية ضوئية. ولتحديد الخلايا البارزة، استخدم الفلورية فوق البؤرية (epi fluorescence) لتصور البشرة المسمى بـ GFP وتحديد مجموعة من الخلايا في نمط الوردة الكلاسيكي الذي يتكون من تجمع من الخلايا يحيط بخلية مستديرة صغيرة في المنتصف.

بالإضافة إلى ذلك، يجب أن يظهر تراكم للأكتين المسمى بـ RFP على شكل حلقة حول الخلية المستديرة الصغيرة في المنتصف، وهي علامة مميزة لعملية طرد الخلايا. وبمجرد تحديد الخلية التي يتم طردها، قم بتعيين الحدود العليا والسفلى لسلسلة Z وحجم الخطوة بسرعة. ثم ابدأ في الحصول على أربع مجموعات بيانات مجهرية بؤرية (Confocal) لعرض البيانات وتصور انقباض حلقة الأكتين والسلوكيات الظهارية التي تحدث حول الخلية الميتة.

بمرور الوقت، قم بعمل مساقط ثلاثية الأبعاد لسلسلة Z واحفظ البيانات كملف فيديو. يمكن تنفيذ هذه الخطوة باستخدام مجموعة متنوعة من الحزم البرمجية. يوضح هذا الشكل تعبير RFP UTR CH في بشرة يرقات zebrafish من نوع CK GFP بعد أربعة أيام من الإخصاب.

تظهر هنا مساقط Z لإطارات ثابتة من فيلم تصوير زمني يتبع ديناميكيات التفاعل الحي. وتظهر الأسهم أثناء عملية طرد الخلايا الظهارية حلقة الأكتين التي تشكلها الخلايا المجاورة، والتي تتقلص وتغلق على مدار دقيقتين. وبناءً على هذا الإجراء، يمكننا استخدام طرق أخرى بالتزامن مع هذه التقنية، مثل استخدام المثبطات الكيميائية أو الطفرات الجينية، لفهم كيف يمكن أن يؤدي تغيير عملية الطرد إلى حالات مرضية معينة بشكل أفضل.

بناءً على الفشل في إزالة الخلايا الميتة المبرمجة، لقد عرضنا لكم للتو كيفية إعداد تجربة تصوير بفاصل زمني لتصور عملية البثق من بشرة جنين سمكة الزيبرا النامية. عند إجراء هذا الإجراء، من المهم تذكر الحد من كمية الضوء المعرضة للعينة لمنع أي تبييض ضوئي أو سمية. هذا كل شيء.

شكراً لكم على المشاهدة، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.