باستخدام ورقة ضوء مضان المجهري لصورة التنمية الزرد العين

الهدف العام من هذا البروتوكول التجريبي هو تصوير تطور العين لجنين الزرد في مجهر الورقة الضوئية ومعالجة مجموعة البيانات متعددة المشاهدات المكتسبة في Figi عبر المكون الإضافي لتطبيق إعادة البناء متعدد الرؤية. يمكن أن تساعدك هذه الطريقة على فهم الأحداث المورفوجينية في نمو. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنه يمكنك ملاحظة الأحداث المورفولوجية في الجنين النامي في اللباقة بدقة مكانية وزمانية عالية.

تتمثل الميزة الرئيسية للفحص المجهري للورقة الضوئية في السمية الضوئية المنخفضة للطريقة ، وتوقيت الاستحواذ السريع الذي يمكنك من خلاله تصوير العينة وأنه يمكنك تصوير العينة من زوايا مختلفة ، ما يسمى بالمناظر. يسمح لنا التقاط العينة من طرق عرض مختلفة بالتغلب على تدهور الإشارة والمحور المحدد. يمكن بعد ذلك استخدام هذه الصور المختلفة وتسجيلها باستخدام كريات مجهرية فلورية حول العينة.

يمكننا إعادة بناء الحجم ثلاثي الأبعاد للوصول إلى الدقة المتناحية. على الرغم من أننا نوضح استخدام الفحص المجهري الدقيق للصفائح الخفيفة لتطوير عين الزرد ، إلا أنه يمكن استخدام هذه الطريقة أيضا للإجابة على أسئلة مختلفة في علم الأحياء التنموي وعلم الأعصاب باستخدام كائنات نموذجية مختلفة. للبدء ، قم بربط هدف الكشف في المجهر مع الحفاظ على الأهداف المضيئة مغطاة.

بعد ذلك ، قم بفك غطاء الأهداف وحرك غرفة العينة بعناية في المجهر. قم بتأمين الغرفة عن طريق شد المسمار. ثم قم بتوصيل مسبار درجة الحرارة وكتلة بلتيير بالمجهر.

الأنبوبان اللذان يعملان على تدوير سائل التبريد لكتلة بلتيير متوافقان مع كلا الموصلين ويمكنهما العمل في أي من الاتجاهين. بعد ذلك ، استخدم حقنة لتحميل الغرفة من خلال المحقنة بمحلول يصل إلى الحافة العلوية لنوافذ الغرفة والتحقق من وجود تسريبات. الآن ، قم بتشغيل المجهر والكمبيوتر والحضانة.

ابدأ تشغيل برنامج تشغيل المجهر واضبط درجة حرارة الحضانة على 28.5 درجة مئوية. بينما تتطلب درجة الحرارة لمدة ساعة ، قم بإعداد العينة. ابدأ بتحضير الاغاروز.

قم بإذابة مليلتر واحد محضر من 1٪ نقطة انصهار منخفضة agarose في E ثلاثة متوسطات عند 70 درجة مئوية. بعد حوالي 15 دقيقة ، انقل 600 ميكرولتر من الاغاروز المنصهر إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر وأضف 250 ميكرولتر من E ثلاثة متوسطات ، و 50 ميكرولتر من 0.4٪ MS 222 ، و 25 ميكرولتر من محلول مخزون حبة الفلورسنت الدوامة. ضع الأنبوب في كتلة تسخين عند حوالي 39 درجة مئوية للسماح للأغروز بالاقتراب من نقطة التبلور.

بعد ذلك ، ادفع الغطاسات المائلة من التفلون إلى أسفل الشعيرات الدموية الزجاجية ذات القطر الداخلي المليمتر الواحد. تحضير خمسة من هؤلاء. الآن ، قم بدوامة خليط الاغاروز لفترة وجيزة ثم انقل خمسة أجنة بأقل كمية من السائل فيه.

ثم أدخل الشعيرات الدموية واستنشق رأس جنين واحد أولا. يجب أن يدخل الرأس قبل الذيل ولا يمكن أن يكون هناك أي فقاعات هواء. ارسم محلولا كافيا بحيث يكون هناك حوالي سنتيمترين من الاغاروز فوق الجنين وسنتيمتر واحد من الاغاروز تحته.

ارسم جنينا واحدا في كل شعيرات دموية قبل المتابعة. تتطلب هذه الخطوة بعض الممارسة لإتقانها. استعد لذلك باستخدام أجنة غير قيمة.

عندما يتجمد الاغاروز تماما ، قم بتخزين العينات في E ثلاثة وسط عن طريق دعم الشعيرات الدموية إلى جدار دورق مع البلاستيسين مع الفتحة السفلية في المحلول. الآن قم بتجميع حامل العينة. أولا ، أدخل غلامين بلاستيكيين بالحجم المناسب ضد بعضهما البعض في الساق.

يجب أن تكون الشقوق الموجودة على الأكمام متجهة للخارج. بعد ذلك ، قم بإرفاق المسمار المشبك. وأدخل الشعيرات الدموية من خلال الحامل حتى يصبح شريط اللون الأسود مرئيا على الجانب الآخر.

تجنب لمس المكبس. ثم شد المسمار المشبك. بعد ذلك ، ادفع سنتيمترا من الاغاروز من الشعيرات الدموية وقم بقصها.

ثم أدخل الجذع في قرص حامل العينة. قبل تحميل نموذج القرص، تحقق من أن المرحلة في أعلى موضع في برنامج التحكم. بعد ذلك ، استخدم قضبان التوجيه لتحريك الحامل وأخذ عينة في المجهر.

الآن ، قم بتصوير العينة المختارة كما هو موضح في بروتوكول النص. تتم معالجة البيانات في Figi. إنه توزيع ImageJ.

قبل البدء ، يجب تحديث Figi. احفظ مجموعة بيانات الصورة المكتسبة في مجلد واحد. سيتم حفظ الملفات الوسيطة لمعالجة الصور في نفس المجلد.

الآن ، ابدأ تطبيق إعادة بناء العرض المتعدد. ثم حدد مجموعة بيانات جديدة. حدد الخيار Zeiss Lightsheet Z.1 Dataset LOCI Bioformats وقم بإنشاء اسم لملف بيانات الإخراج.

ثم حدد أول ملف CZI لمجموعة البيانات. سيتم تحميل البيانات الوصفية تلقائيا. في البيانات الوصفية للصورة ، تحقق جيدا من ضبط عدد الزوايا والقنوات والإضاءات وحجم الفوكسل بشكل صحيح.

عند الضغط على موافق ، نافذة سجل ، تفتح نافذة مستكشف إعداد العرض ، ونافذة وحدة التحكم. يوفر مستكشف إعداد طريقة العرض واجهة سهلة الاستخدام. حدد الملفات التي تحتاج إلى معالجة واضغط على زر الماوس الأيمن.

سيتم فتح نافذة جديدة تعرض خطوات المعالجة المختلفة أثناء تنفيذها. في الزاوية اليمنى العليا توجد أزرار المعلومات والحفظ. يعرض Info ملخصا لمحتوى ملف البيانات المحفوظة وسيؤدي الضغط على Save إلى حفظ نتائج المعالجة.

يقوم البرنامج بحفظ نتائج خطوات المعالجة بخلاف ذلك. لإعادة حفظ مجموعة البيانات بأكملها ، أولا ، حدد جميع الملفات بالضغط على Ctrl + A وباستخدام النقر بزر الماوس الأيمن. ثم حدد إعادة حفظ مجموعة البيانات وAs HDF5.

يجب بعد ذلك تحديد تأكيد إجراء إعادة الحفظ. بعد بضع دقائق ، لكل نقطة زمنية ، سيشير البرنامج إلى اكتمال إعادة الحفظ. ثم تابع الكشف عن نقاط الاهتمام في البيانات.

حدد جميع النقاط الزمنية بالضغط على Ctrl + A والنقر بزر الماوس الأيمن. للتحديد، اكتشف نقاط الاهتمام. من الخيارات ، حدد فرق الغوس.

وحدد عينة من الصور قبل التجزئة. في النافذة التالية ، اختر إعدادات الكشف. من خيارات ترجمة البكسل الفرعي، حدد ملاءمة تربيعية ثلاثية الأبعاد.

ثم ، في مواصفات نقطة الاهتمام ، حدد تفاعلي. بالنسبة لخيار XY للعينة السفلية، حدد مطابقة دقة Z. وبالنسبة للعينة Z ، حدد 1x.

بعد ذلك، قم بتنفيذ العملية عن طريق تحديد خيار الحساب على وحدة المعالجة المركزية Java. من النافذة المنبثقة ، حدد طريقة عرض واحدة لاختبار المعلمات. بمجرد تحميل العرض ، اضبط السطوع والتباين بالضغط على Ctrl + Shift + C على لوحة المفاتيح.

أيضا ، للكشف عن الخرزة ، قم بتبديل البحث عن خيار الحد الأقصى الأخضر. لاحظ الآن التجزئة حيث حلقات خضراء حول الاكتشافات. اضبط قيم الفرق في gaussien لمعلمات سيجما واحدة والعتبة لتقسيم الخرزات على النحو الأمثل مع الحد الأدنى من الإيجابيات الخاطئة.

يجب اكتشاف كل حبة مرة واحدة فقط. بعد تحديد المعلمات المثلى ، اضغط على تم. بعد تحميل الكمبيوتر, كل عرض فردي للنقطة الزمنية وتقسيم الخرز, يقوم البرنامج بإخراج ملف سجل مع عدد الخرزات التي اكتشفها في كل عرض.

يجب أن يكون هناك ما بين 600 وعدة آلاف من الخرزات لكل عرض. خلاف ذلك ، تحتاج معلمات الكشف إلى التغيير والتبديل. هذه عملية صعبة.

نادرا ما يكون هرم الكشف دقيقا في المحاولة الأولى ويمكن أن تختلف عمليات إعادة الضبط بين النقاط الزمنية لفيلم واحد. سيساعد الاسترخاء الطازج باكتشاف جميع الخرزات الحقيقية والسماح بمزيد من الإيجابيات الكاذبة. إذا لم تنجح أي مجموعة من الهرم ، فيجب الحصول على مجموعة بيانات جديدة باستخدام حبات فلورية مختلفة.

تابع الآن تسجيل الاكتشافات وإجراء فك عرض متعدد من المكدس. LSFM هي طريقة مثالية لتصوير العمليات التنموية على نطاقات متعددة من الهياكل بين الخلايا إلى الخلايا والأنسجة بأكملها لفترات طويلة من الزمن. يمكن التقاط الأحداث بين الخلايا السريعة جدا بدقة عالية ، مثل نمو الأنابيب الدقيقة في الخلايا السلفية العصبية.

من فيلم عرض واحد ، يمكن القياس الكمي لنمو الأنابيب الدقيقة. يمكن متابعة الهياكل داخل الخلايا على مدى عدة ساعات مثل الجسيم المركزي داخل الخلايا العقدية الشبكية. يمكن استخراج سلوك الخلية المفردة من صور الأنسجة الكاملة مثل الموقع العابر للخلية العقدية عبر شبكية العين.

ينشئ فك الالتفاف متعدد المشاهدات مكدس Z متناحي واحد من خلال الجمع بين عدة طرق عرض مختلفة باستخدام وظيفة انتشار النقاط. يوفر هذا صورا محسنة بشكل كبير مقارنة بطرق العرض الفردية أو الاندماج المتوسط المرجح. على سبيل المثال ، يمكن دراسة تحويل الحويصلة البصرية إلى كوب بصري من شرائح بصرية في اتجاهات مختلفة من خلال مجموعة البيانات المعروضة.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن جودة الصورة الجيدة بشكل عام ، حتى في أعماق الجنين واضحة. كما هو الحال عند عرض تشكل الكوب البصري. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تركيب صورة أجنة الزرد في مجهر ورقة ضوئي.

وكيفية معالجة مجموعات البيانات متعددة المشاهدات في Figi. بمجرد إتقانها ، سيستغرق الأمر حوالي ساعتين لبدء تجربة الفاصل الزمني على مجهر الألواح الضوئية. سيستغرق تحليل البيانات اللاحق وقتا أطول بكثير.

قد يكون من المفيد استخدام مجموعة كمبيوتر لهذه المهمة. يمكن العثور على المزيد من النصائح العملية ونصائح حل المشكلات وروابط لموارد أخرى في بروتوكول النص. يجب أن تكون هناك سعة تخزين كافية وخطة أنابيب معالجة بيانات واضحة متاحة قبل التجربة.

إذا كانت لديك أي مشاكل أو أسئلة أو طلبات مستقبلية ، فيرجى الرجوع إلى موقع الويب الخاص بالميزات أو مشكلات الملفات في مستودعات github المعنية.