تحديد أنواع غشاء الميتوكوندريا المحتملة والأوكسجين التفاعلي في الخلايا العصبية الفئران الحية القشرية

الهدف من هذا الإجراء هو تحديد جهد الغشاء الميتوكوندري ومستويات أنواع الأكسجين التفاعلية في العصبونات القشرية الأولية باستخدام المسبارات الفلورية TMRM و H 2D CFD على التوالي. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضير تركيزات مخزنة وتركيزات عمل من TMRM و H 2D CFDA. وتتمثل الخطوة الثانية في تحضين العصبونات القشرية مع TMRM و H 2D CFDA في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة في محلول Thai roads المنظم.

تتمثل الخطوة الثالثة في تصوير شدة الفلورة لـ TMRM و DCF في عصبونات قشرية حية باستخدام إثارة وانبعاث بطول موجي 515 و 517 نانومتر و 488 و 515 نانومتر على التوالي. سيتم رصد التغيرات في فلورة TMRM في وجود فك الارتباط الميتوكوندري FCCP، بينما سيتم رصد التغيرات في فلورة DCF في وجود بيروكسيد الهيدروجين. وتتمثل الخطوة النهائية من هذا الإجراء في جمع البيانات ومعايرتها وتحليلها.

في النهاية، يتم الحصول على النتائج عن طريق رسم مخطط بياني يوضح المستويات النسبية لشدة فلورة TMRM وDCF قبل وبعد المعالجة بـ FCCP وببيروكسيد الهيدروجين على التوالي. مرحباً، أنا جوانا كوسكا. مرحباً بكم في مختبري بجامعة لويولا في شيكاغو.

سنوضح لكم اليوم كيفية قياس جهد غشاء الميتوكوندريا وأنواع الأكسجين التفاعلية في العصبونات القشرية للفئران. سيقوم بتقديم هذا الإجراء dhi. مرحباً، أنا Denise Jossi.

باستخدام هذا الإجراء، يمكن قياس جهد الغشاء الميتوكوندري عند وسم ميتوكوندري واحد، وقياس أنواع الأكسجين التفاعلية عند وسم خلية واحدة. لذا لنبدأ. قم بتحضير محلول مخزون من TMRM بتركيز 10 millimolar عن طريق إذابة خمسة milligrams من TMRM في one milliliter من anhydrous dimethyl sulf oxide، ثم استخدم جهاز vortex لمدة one minute.

بعد ذلك، قم بتقسيم المحلول إلى حصص صغيرة (aliquots) واحفظ هذه الحصص عند درجة حرارة -20 °C. يجب حماية المحلول من الضوء واستخدامه في غضون شهر واحد. بعد ذلك، قم بتحضير محلول مخزون بتركيز 10 mM من H 2D CFDA عن طريق إذابة 4.87 mg من H 2D CFDA في 1 mL من dimethyl sulf oxide اللامائي.

وبالمثل، قم بالرج باستخدام جهاز الفورتيكس لمدة دقيقة واحدة، ثم قسم المحلول إلى حصص (aliquots) واحفظها عند درجة حرارة 20- درجة مئوية. احفظ العينات بعيداً عن الضوء واستخدمها خلال أسبوع واحد لتحميل العصبونات القشرية للجرذ بصبغة TMRM أولاً. اغسل العصبونات المستزرعة ثلاث مرات باستخدام محلول tyro's buffer.

بعد ذلك، قم بتحضير TMRM بتركيز 20 nano molar عن طريق تخفيف محلول TMRM المخزون بتركيز 10 millimolar بمقدار 1000 مرة في tb. ثم أضف 2 µL من TMRM المخفف لكل 1 mL من tb. قم بتحضين الخلايا العصبية مع TMRM لمدة 45 دقيقة في الظلام وفي درجة حرارة الغرفة.

بعد مرور 45 دقيقة، ضع طبق المزرعة على منصة المجهر وابدأ التصوير لتحميل العصبونات القشرية للجرذ بـ H 2D CFDA، واغسل العصبونات المزروعة ثلاث مرات باستخدام tb. بعد ذلك، قم بتحضير تركيز 2 µM من H 2D CFDA عن طريق تخفيف المخزون من H 2D CFDA بتركيز 10 mM بمقدار 10 مرات في tb. ثم أضف 2 µL من H 2D CFDA المخفف لكل 1 mL من tb.

بعد ذلك، يتم تحضين العصبونات مع H 2D CFDA لمدة 45 دقيقة في الظلام وبدرجة حرارة الغرفة. اغسل العصبونات أربع مرات باستخدام TB لإزالة المؤشر الفلوري الزائد قبل الحصول على الصور لإجراء التصوير الحي للعصبونات المحضنة مع TMRM باستخدام مجهر المسح الليزري البؤري مع تطبيق برنامج السلاسل الزمنية الحية. استخدم دقة منخفضة وقوة ليزر مخففة لتقليل الوقت اللازم للحصول على الصور ولتجنب التبييض الضوئي.

بعد ذلك، قم بضبط تركيز الخلايا العصبية المثبتة والمحملة بـ TMRM باستخدام الضوء المنعكس. افحص فلورية TMRM عن طريق الإضاءة عند 540 nanometers والكشف عند 570 nanometers. اضبط كسب الكشف للكاميرا ليكون أقل بقليل من مستوى التشبع بمجرد ضبط جميع المعاملات، والتي تشمل الدقة، وكشف قدرة الليزر، وكسب الكاميرا، والفاصل الزمني للتصوير المتتابع (time-lapse) للحصول على الصور.

لا تغير هذه الإعدادات بين التجارب. بعد ذلك، قم بتغيير الحقل. ابدأ في جمع الصور لاختبار التغيرات في محفز delta PSY M، حيث يمكن تطبيق 1 µM من FCCP أو 2 µg/mL من oligomycin، مما سيؤدي إلى إزالة استقطاب أو زيادة استقطاب جهد الغشاء الميتوكوندري بشكل ملحوظ على التوالي.

ستنعكس هذه التغييرات من خلال انخفاض في شدة فلورة TMRM مقارنة بشدة الفلورة المرجعية في حالة استخدام FCCP أو زيادة في شدة فلورة TMRM. وفي حالة إجراء التصوير الحي للخلايا العصبية المحضنة مع H 2D CFDA، قم أولاً بتثبيت طبق الزرع على منصة المجهر، واضبط تركيز الخلايا باستخدام الضوء المنعكس. افحص فلورة DCF عن طريق الإثارة عند 4 88 nanometers والانبعاث عند five 15 nanometers.

بعد ذلك، اضبط قدرة الليزر لتكون بين 5 إلى 7%، وحدد الكسب ودقة ميز 256 × 256. لا تغير هذه الإعدادات بين التجارب. ثم اضبط التردد اللازم للحصول على صور حية.

باستخدام برنامج السلاسل الزمنية (Time series)، اختر مجالاً جديداً وابدأ في التقاط الصور للكشف عن التغيرات في مستويات R os. قم بمعالجة الخلايا بـ 100 إلى 200 micromolar من بيروكسيد الهيدروجين. سينعكس ذلك من خلال زيادة في شدة فلورة DCF مقارنة بمستوى الخط القاعدي.

استخدم أداة تحديد المنطقة ذات الأهمية (region of interest tool) من برنامج LSM لتحديد المناطق. بعد ذلك، اختر المناطق ذات الأهمية (ROIs) من مناطق الميتوكوندريا أو المناطق ذات الأهمية من جسم الخلية بأكمله في صور الخلايا؛ وذلك لقياس شدة الفلورسنت لـ TMRM أو ROS على التوالي.

حدد مناطق بجوار الخلايا. ولحساب شدة الفلورة للخلفية، قم بأخذ عدة قياسات، ومن ثم احسب متوسط شدة الخلفية، واطرح متوسط شدة فلورة الخلفية من متوسط شدات الفلورة للمناطق ذات الاهتمام في كل خلية عند كل نقطة زمنية باستخدام برنامج Microsoft Excel. وبعد طرح شدة الخلفية، قم بتطبيع شدة فلورة TMRM أو DCF بالنسبة للفلورة المرجعية (baseline).

باستخدام هذه الصيغة، استخدم برنامج Sigma plot لإنشاء المخطط الذي يوضح التغيرات في شدة الفلورة بمرور الوقت. إليك مثال على صورة فلورية لعصبونات قشرية من الجرذ تم تحضينها بـ TMRM. تؤدي إضافة فك الاقتران الميتوكوندري F-C-C-P-A إلى إزالة الاستقطاب الميتوكوندري وفقدان شدة فلورة TMRM.

يظل مستوى فلورة TMRM الأساسي مستقراً قبل إضافة FCCP. ويظهر التحليل الكمي لتغيرات فلورة TMRM بمرور الوقت انخفاضاً ملحوظاً في فلورة TMRM بعد إضافة FCCP. إليكم مثالاً لصورة فلورية لعصبونات قشرية من الجرذ محملة بـ DCF.

يبقى مستوى فلورة DCF الأساسي دون تغيير في أول 120 ثانية قبل إضافة بيروكسيد الهيدروجين. وتؤدي إضافة بيروكسيد الهيدروجين إلى زيادة في شدة فلورة DCF في أجسام الخلايا. وتظهر قياسات فلورة DCF بنظام التصوير الزمني (Time-lapse) مستويات مستقرة تزداد بعد المعالجة ببيروكسيد الهيدروجين.

في هذا الإجراء، من المهم تذكر استخدام قدرة ليزر منخفضة وسرعة مسح سريعة لتجنب الشوائب الناتجة عن التبييض الضوئي والسمية الضوئية. نتمنى لك التوفيق في تجربتك.