تحديد مورفولوجيا الميتوكوندريا في الخلايا الحية باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر

يركز بحثنا على علم الأدوية العصبية الأساسي. على وجه التحديد ، ندرس كيفية عمل جزيئات الدواء. نهدف إلى فهم العلاقة بين المركبات الدوائية المحتملة ووظيفة الميتوكوندريا في مرض باركنسون.

تستعرض الدراسات السابقة تحديات تحليل خلايا المختبر طويلة الأمد حتى مع إرشادات الشركة المصنعة. لحل هذه المشكلة ، حددنا بروتوكولا مفصلا خطوة بخطوة لتقييم مورفولوجيا الميتوكوندريا في خلايا المختبر. يستخدم بروتوكولنا صبغة ميتوكوندريا بسيطة وتصوير مضان وبرامج مفتوحة المصدر.

هذا يقلل من التكلفة ويزيد من إمكانية الوصول ويجعله أسهل في الاستخدام من البدائل المعقدة مثل المجهر الإلكتروني. للبدء ، احصل على مزارع من خلايا SH-SY5Y المزروعة في قوارير تحتوي على DMEM / F12 ، مع 10٪ FBS. افصل الخلايا لمدة دقيقة واحدة باستخدام محلول 0.05٪ تريبسين.

ثم قم بالطرد المركزي للخلايا عند 100 جرام لمدة ثلاث دقائق قبل المرور. بعد ذلك ، قم بتعليق خلايا SH-SY5Y في وسط DMEM / F12 المكمل ب 1٪ FBS. ثم زرع الخلايا في أطباق متحد البؤر مع قيعان زجاجية والحفاظ عليها طوال الليل.

بالنسبة للتحفيز MPP + ، استبدل وسط الاستزراع بوسط طازج مع أو بدون 1-ميثيل -4-فينيل بيريدينيوم لمدة 24 ساعة. لتلوين MitoTracker ، قم بتخفيف محلول مخزون MitoTracker بوسط DMEM / F12 مسخن مسبقا للحصول على تركيز عمل 50 نانومولار. حافظ على محلول التلوين محميا من الضوء طوال الإجراء.

قم بإزالة وسط الاستزراع من الأطباق متحد البؤر. اغسل الخلايا مرتين باستخدام DMEM / F12 الطازج. ثم قم بإضافة ملليلتر واحد من محلول العمل MitoTracker في الطبق.

احتضن لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام. الآن قم بإزالة محلول العمل MitoTracker واغسل الأطباق مرتين باستخدام DMEM / F12. بعد الغسيل الأخير ، أضف مليلتر واحد من DMEM / F12 إلى كل طبق.

احتضان في حاضنة الخلية قبل التصوير. لتحقيق التوازن المسبق للمجهر متحد البؤر للتصوير ، تحت لوحة الاستحواذ ، اضبط معلمات مسار الضوء عن طريق ضبط الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث. اضبط حجم الثقب على 1.2 وحدة جيدة التهوية ، وحجم مسح البكسل على 1024 × 1024 ، ووقت بقاء البكسل على 2.4 ميكروثانية بمتوسط اثنين.

استخدم الآن ضوء الهالوجين للتركيز على الخلايا باستخدام عدسة موضوعية 60X ذات مخطط بفتحة عدسة عددية تبلغ 1.4 ، مما يقلل من السمية الضوئية. اضبط طاقة الليزر والجهد العالي أقل بقليل من مستوى التشبع. ثم اضبط عامل التكبير على ثلاثة والتقط الصور.

حرك منطقة الاهتمام للتركيز على الخلايا الأخرى تحت المجهر. ثم التقط الصور دون تغيير أي إعدادات. لتحسين جودة الصورة قبل التحويل الثنائي والهيكل العظمي ، افتح الصورة أولا.

حدد مساحة خلية واحدة باستخدام أداة عائد الاستثمار. الآن ، انقر بالتتابع على العملية والمرشحات ووظيفة القناع غير الحاد لتعزيز الحدة. ثم استخدم العملية وتحسين التباين لتقليل تضخيم الضوضاء.

انقر فوق العملية والمرشحات والخيار المتوسط لإزالة ضوضاء الملح والفلفل. لتحويل الصورة إلى ثنائي ، انقر فوق العملية متبوعة بثنائي واختر خيار جعل ثنائي. قم بهيكل الصورة الثنائية بالنقر فوق العملية والثنائية والهيكل العظمي.

ثم قم بتجميع جميع وحدات بكسل الهيكل العظمي عن طريق تحديد تحليل ، متبوعا بالهيكل العظمي وتحليل وظيفة الهيكل العظمي 2D 3D. قم بتبسيط التحليل باستخدام أداة MiNA لحساب تسع معلمات وصفية في الصورة الهيكلية. زادت شدة التألق لتلوين الميتوكوندريا تدريجيا مع تركيز MitoTracker الأحمر CMXRos من 25 نانومولار إلى 200 نانومولار.

ولكن عند 200 نانومولار ، لوحظ تلطيخ كبير في الخلفية السيتوبلازمية. تم الحفاظ على مورفولوجيا الميتوكوندريا بشكل أفضل في وسط DMEM / F12 مقارنة ب PBS في ساعة واحدة بعد التلوين ، على الرغم من أن DMEM / F12 أظهر أيضا مضان أعلى في الخلفية. أدى متوسط الإطار المزدوج إلى تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء بشكل كبير في تصوير الميتوكوندريا مقارنة بوضع المسح الفردي.

وأدت زيادة وقت بقاء البكسل من 2.4 إلى 10.8 ميكروثانية إلى ظهور صور أكثر إشراقا ، ولكنها تسببت في التبييض الضوئي. أدت زيادة الجهد العالي إلى تكثيف ضوضاء الخلفية ، بينما أدت زيادة طاقة الليزر إلى التبييض الضوئي. أنتجت أداة MiNA مخرجات هيكلية متسقة لكل من الصور الخافتة والساطعة ، مما يشير إلى تجزئة قوية عبر شدة مضان مختلفة ، حيث تظهر الصورة الساطعة كثافة أعلى بمقدار 5.5 أضعاف من الصورة الخافتة.

أدى العلاج MPP + عند 500 ميكرومولار إلى تعطيل مورفولوجيا الميتوكوندريا في خلايا SH-SY5Y مقارنة بالتحكم غير المعالج ، مما أدى إلى انخفاض كبير في بصمة الميتوكوندريا.