الميل عبر الغشاء Oligomerization المجال يحدده الفحص ToxR

الهدف العام من التجربة التالية هو استقصاء ميول تكوين الروابط (ligamentization) للبروتينات، أو النطاقات عبر الغشائية (T MDs) في بيئة غشائية طبيعية. ويتحقق ذلك عن طريق التعبير عن النطاق عبر الغشائي المستهدف في بكتيريا e coli كبروتين خيمري مع بروتين ربط المالتوز (maltose binding protein) لتوجيهه إلى الحيز المحيطي (periplasm) واستخدام tox. R كراصد نسخ؛ حيث يؤدي تكوين الروابط الناجم عن النطاق عبر الغشائي إلى ديمرة tox R وتنشيط نسخ LXi. وفي خطوة ثانية، يتم تحلل الخلايا ومعالجتها بـ ONPG، والذي يتم تحلله مائياً بواسطة beta galacto إلى مادة O nitro pholate أو ONP الماصة للضوء.

بعد ذلك، يتم قياس مستويات ONP كمياً عن طريق قياس امتصاص الضوء عند 405 nanometers. ومن أجل تحديد مستويات النطاق عبر الغشائي، تكشف نتائج الـ ligamentization عن ميل النطاقات عبر الغشائية للـ ligamentization بناءً على مقايسة reporter الخاص بـ tox R. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الفيزيائية الحيوية الحالية مثل SDS page أو الفلورية في أن سلوك النطاق عبر الغشائي يُدرس في طبقة ثنائية من الفسفوليبيدات الطبيعية من خلال التعبير في e coli بدلاً من استخدام نظام محاكاة للغشاء مثل المذيبات المنظفة (detergents) وحدها.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال بروتينات الغشاء، مثل توضيح السمات الهيكلية الأساسية المشاركة في ارتباط اللولب عبر الغشائي. قبل البدء في هذا البروتوكول، يتم تحضير سبعة بلازميدات تعبر عن البروتين الخيمري المطلوب من أوليغونوكليوتيدات مصنعة تجارياً، والتي تمثل تسلسلات الـ TDS المستهدفة والمحاطة بمواقع القطع NHE one و BMH one. بعد تحضير البلازميدات، يتم إذابة الخلايا المختصة fhk 12 بلطف على الثلج. وبمجرد ذوبانها، تُنقل الخلايا إلى أنابيب زرع سعة 15 milliliter، ويُضاف 200 nanograms من كل حمض نووي بلازميدي (plasma DNA) إلى أنبوب منفصل، ثم تُحضن الخلايا على الثلج لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك، تُعرض الخلايا لصدمة حرارية لمدة 90 ثانية عند 42 °C، يلي ذلك تحضينها على الثلج لمدة دقيقتين في 800 µL من وسط SOC، ثم تُحضن العينات عند 37 °C مع الرج لمدة ساعة واحدة. بعد التحضين، يتم تلقيح 5 mL من وسط LB الذي يحتوي على الكلورامفينيكول و aose بـ 50 µL من خليط التحول باستخدام أنابيب زرع سعة 15 mL في ثلاث مكررات لكل عينة. وأخيراً، تُحضن العينات عند 37 °C مع الرج لمدة 20 ساعة. ولقياس عملية الربط الكاملة، يتم تحديد نشاط TDS beta galacto tase.

أولاً، قم بتسخين قارئ الأطباق مسبقاً إلى 28 °C. استخدم المخزون المركز من Z buffer لتحضير محاليل Z buffer طازجة كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. انقل Z buffer chloroform من الأنبوب إلى الخزان، مع التأكد من سحب الطبقة المائية العلوية فقط من Z buffer chloroform باستخدام الماصة.

ضع طبق الـ 96 بئراً فوق ورقة مرسوم عليها شبكة لضمان دقة عملية النقل بالماصة، ثم انقل 100 µL من محلول Z buffer chloroform إلى كل بئر من آبار طبق الـ 96 بئراً، يتبع ذلك إضافة 5 µL من كل مستنبت في أربع مكررات. استثنِ المستنبت من الآبار الأربعة التي ستعمل كعينات فارغة (blanks). قم بقياس OD 595 للطبق لتحديد الكثافة الخلوية.

أضف 50 µL من Z buffer SDS إلى جميع آبار اللوحة. بعد ذلك، رج اللوحة في قارئ الأطباق لمدة 10 دقائق لتحليل الخلايا، ثم أضف 50 µL من ZPA for ONPG إلى جميع الآبار بعد عملية تحليل الخلايا. أعد اللوحة إلى قارئ الأطباق وقم بقياس OD 405 كل 30 ثانية لمدة 20 دقيقة.

قم بتحديد مستوى نشاط بيتا لاكتاماز من خلال حساب وحدات ميلر مع المعايرة بالنسبة للعينة الضابطة (blank). يتم إجراء تحليل لطخة وسترن للتحقق من تماثل التعبير البروتيني بين البناءات الجينية. أولاً، اخلط 50 µL من المزارع المكررة ثلاث مرات، ثم قم بطرد العينات مركزياً باستخدام جهاز طرد مركزي دقيق.

أزل الطافي باستخدام الماصة وأعد التعليق. قم بتعليق الراسب المتبقي في محلول تحميل العينات (2x sample loading buffer)، ثم حمّل 7.5 µL من كل عينة على هلام قياسي بنسبة 8%، وأجرِ عملية الرحلان الكهربائي عند 125 volts لمدة ساعة وخمس دقائق. بعد النقل، قم بتحضين الغشاء باستخدام جسم مضاد مقترن بـ anti M-V-P-H-R-P لتصور البروتين الخيمري الذي يظهر عند 70 kilodaltons تقريبًا، مع ظهور بعض منتجات التحلل أحيانًا حول 48 kilodaltons.

يُلاحظ أيضاً وجود بروتين MVP داخلي المنشأ عند 45 kilodaltons. ولتقييم الإدراج الغشائي السليم لبنية TMD الخيمرية، يتم استخدام خط خلايا PD 28 المفتقر إلى بروتين ربط المالتوز؛ فعندما تُزرع هذه الخلايا في أوساط غذائية دنيا يكون فيها المالتوز هو مصدر الكربون الوحيد، لا يمكن أن تنمو إلا الخلايا التي تعبر عن منتج تعبيري مدمج في الغشاء يحتوي على بروتين ربط المالتوز الموجود بشكل صحيح في الجبلة المحيطية (periplasm). يتم تحويل خلايا PD 28 كما هو موضح لخلايا fhk 12، ثم يتم تلقيح ملي لترين من وسط LB.

قم بتنمية الخلايا عند 37 درجة مئوية مع الرج بسرعة 300 RPM طوال الليل بعد الحضن. قم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي واغسلها بإعادة التعليق في 2 mL من PBS والمناداة اللطيفة باستخدام طرف ماصة كبير. بعد الترسيب، تُغسل الخلايا مرة أخرى بـ PBS للمرة الثانية، ثم يتم إجراء طرد مركزي نهائي وإعادة التعليق في 1 mL من PBS.

استخدم 25 µL من الخلايا المعاد تعليقها لتلقيح خمسة ملليلترات من الوسط الغذائي الأدنى. يتم تحضين الخلايا عند 37 °C مع الرج لمدة 15 ساعة. انقل 200 µL من كل عينة إلى لوح معايرة ذو 96 بئرًا، ثم قم بقياس قيمة OD 595 باستخدام قارئ الأطباق.

كرر هذه العملية كل ساعتين حتى مرور 25 ساعة. تم تحليل ميل جميع النطاقات عبر الغشائية الفردية من البروتين الغشائي المدمج متعدد العبور "latent membrane protein one" إلى تكوين روابط باستخدام مقايسة المراسل النسخي tox R. يُظهر النطاق عبر الغشائي الخامس ميلاً قوياً لتكوين روابط كما يتضح من وحدات Miller العالية، وهو ما يماثل تسلسل dimerizing المعروف في الضابط الموجب GPAA.

تؤدي طفرة ضارة في النطاق عبر الغشائي الخامس D1 50 A إلى تقليل قدرة التسلسل على الارتباط بـ LMP1، بينما لا يرتبط TM1 بشكل ملحوظ ويظهر إشارة وحدة ميلر منخفضة للغاية، أعلى بقثير من إشارة العينة الفارغة، وهي خلايا FHK 12 غير المحولة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد ما إذا كان اللولب عبر الغشائي المستهدف يمتلك القدرة على تكوين معقدات من رتب أعلى في بيئة غشائية طبيعية. أثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم استخدام الماصة بدقة متناهية عند الإضافة إلى طبق 96 بئراً لتجنب الأخطاء الكبيرة وضمان عدم دخول فقاعات هواء.