ثلاثي الأبعاد البصرية الميكروسكوب الضوئي الاستبانة

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح مجهر التصوير الصوتي الضوئي ذو الدقة البصرية، أو Pam، للدورة الدموية الدقيقة في الجسم الحي، بحيث يكون غير باضع وخالٍ من الوسوم. يتم تحقيق ذلك أولاً بتخدير الحيوان التجريبي. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تحديد منطقة الاهتمام عن طريق تحريك رأس التصوير الخاص بمجهر التصوير الصوتي الضوئي ذو الدقة البصرية، ثم يتم ضبط معايير المسح وبدء عملية الحصول على الصور.

في نهاية المطاف، يتم الحصول على توزيعات تركيز الأكسجين الكلي وتشبع الهيموغلوبين بالأكسجين من خلال حساب البيانات التجريبية متعددة الأطوال الموجية. تعتمد المجهرية الصوتية الضوئية ذات الدقة البصرية على الإثارة بالليزر والكشف بالموجات فوق الصوتية؛ حيث يتم تركيز شعاع ليزر نبضي قصير داخل النسيج البيولوجي.

يؤدي امتصاص الضوء إلى توليد تسخين عابر وانبعاثات فوق صوتية لاحقة، يتم استقبالها لتكوين صورة. وتكمن الميزة الفريدة لـ RPM في كونها طريقة كشف خالية من المواد الملونة وتتمتع بحساسية فائقة للامتصاص الضوئي. وفي المقابل، فإن تقنيات المجهر الضوئي الحالية القائمة على الانعكاس حساسة بشكل أساسي للتشتت الضوئي أو الفلورة. وبفضل قدرته على توفير تصوير عالي الدقة للامتصاص الضوئي في الجسم الحي (in vivo) وبدون استخدام واسمات، وجد RPM تطبيقات طبية حيوية واسعة في مجالات neurology، وophthalmology، وvascular biology، وdermatology.

يتكون المجهر الضوئي الصوتي ذو الدقة البصرية، أو pamm، من مكونات بصرية وأخرى فوق صوتية. مصدر الإشعاع الضوئي هو ليزر صبغي يتم ضخه بواسطة ليزر نبضي من الحالة الصلبة. يتم تخفيف شعاع الليزر الناتج بواسطة مرشح كثافة محايدة، ثم يتم ربطه بألياف ضوئية أحادية النمط لنقل الضوء، وذلك للسماح بالمسح الميكانيكي لرأس تصوير المجهر بدلاً من الجسم الحي، لضمان ربط شعاع الليزر متعدد الأنماط بفعالية في ألياف ضوئية أحادية النمط.

يتم ترشيحه أولاً بواسطة ثقب دقيق بقطر 50 ميكرومتر. يوضع الثقب الدقيق بعيداً قليلاً عن بؤرة عدسة المكثف لمطابقة قطره مع قطر شعاع النمط الأساسي. ولإنشاء بؤرة بصرية محدودة الحيود تقريباً، يتم تجميع مخرجات الألياف أحادية النمط بحيث تملأ الفتحة الخلفية لعدسة المجهر الشيئية.

يتضمن الكشف بالموجات فوق الصوتية مجمع حزم بصري صوتي مُصنع محلياً ومتصلاً بمحول طاقة فوق صوتي. يقوم المجمع بمحاذاة التشعيع البصري والكشف الصوتي بشكل متحد المحور. تم تجويف تجويف كروي في الجزء السفلي من المجمع لإنتاج عدسة صوتية بفتحة عددية قدرها 0.5 في الماء، مما يوفر قطراً بؤرياً صوتياً يبلغ 43 micrometers عند التردد المركزي البالغ 50 megahertz.

بالنسبة للمحاذاة الأولى، يفيد استخدام الموجات فوق الصوتية بنظام صدى النبضات لتحديد موضع المستوى البؤري الصوتي. يتم ضبط رأس التصوير عمودياً حتى يتم رصد أقصى إشارة للموجات فوق الصوتية بنظام صدى النبضات. ولرفع حساسية الكشف إلى الحد الأقصى، يتم إجراء محاذاة بين البؤرتين الضوئية والصوتية. بؤري مشترك.

يتم وضع هدف ممتص بصرياً، مثل قطعة من الشريط الكهربائي الأسود، في المستوى البؤري الصوتي. بعد ذلك، يتم ضبط الموضع البؤري البصري لزيادة الإشارة الصوتية الضوئية إلى أقصى حد. يتضمن نظام PAM أيضاً مضخمات إلكترونية ومحولاً تماثلياً رقمياً، وماسحاً ميكانيكياً ووحدة تحكم في الماسح.

تُنقل الإشارة الرقمية إلى جهاز كمبيوتر لتكوين الصورة. ويقوم البرنامج بتحويل البيانات الخام إلى سلسلة من صور المسح المقطعي. ومع قيام رأس المجهر بعملية المسح النقطي للجسم، يمكن بعد ذلك عرض الصور المسجلة كصور مقطعية فردية، أو صور إسقاط السعة القصوى ثنائية الأبعاد 2D، أو نماذج ثلاثية الأبعاد 3D.

يُستخدم خزان مياه لاحتواء رأس التصوير المجهري. ويتم قطع نافذة تصوير في طبق بتري وإغلاقها بغشاء بولي إيثيلين شفاف بصرياً وفوق صوتياً. وتنتقل الموجة الصوتية الضوئية المتولدة من الجسم عبر اقتران صوتي إلى الكاشف فوق الصوتي أولاً بواسطة جل فوق صوتي يوضع بين الجسم وغشاء البولي إيثيلين، ثم عبر المياه منزوعة الأيونات الموجودة في طبق بتري.

تشكل هذه الابتكارات وتطبيقات ليزرات البصريات المتاحة ومحول الطاقة فوق الصوتي نظام الـ or pam. وفي الجزء التالي، سنقوم بتصوير الأوعية الدموية الدقيقة لفأر حي باستخدام هذا النظام. إذا لم يكن الحيوان الذي يتم تصويره فأراً عارياً، فمن المثالي القيام بعملية dete قبل 24 ساعة من التجربة.

وبذلك يتم تعافي تهيج الأوعية الدموية الجلدية. خُدّر الفأر باستخدام 3% ISO متبخر في أكسجين طبي. يتراوح معدل التدفق النموذجي بين 1 و 1.5 لتر في الدقيقة.

بناءً على وزن جسم الحيوان. يتم الحفاظ على التخدير باستخدام 1% ISO fluorine طوال التجربة، ويُجرى قرص إصبع القدم للتأكد من تخدير الفأر بشكل كامل. يُنقل الفأر إلى منصة التوجيه المجسم (stereotactic stage) مزودة بوسادة تدفئة للحفاظ على درجة حرارة جسمه عند 37 degrees Celsius.

الآن، قم بتسطيح الأذن على اللوح البلاستيكي. ثم ضع طبقة من جل الموجات فوق الصوتية فوق الأذن، مع تجنب حبس فقاعات الهواء داخل الجل.

قم أيضاً بوضع مرهم للعينين لمنع الجفاف أو التلف العرضي الناتج عن الليزر. تجنب لمس العين مباشرةً باستخدام الأداة المطبقة. ثم ضع الأذن تحت نافذة التصوير وارفع منصة الحيوان ببطء حتى يتلامس هلام الموجات فوق الصوتية مع الجزء السفلي من الغشاء.

يجب أن يكون التلامس خفيفاً لأن الضغط على الأذن مقابل الغشاء قد يؤثر على تدفق الدم في الأذن. بعد ذلك، اتخذ بعض الاحتياطات مع الحيوان لمراقبة حالته الفسيولوجية. قم بتثبيت جهاز قياس تأكسج النبض على ساق الفأر أو ذيله.

الآن، اخفض رأس التصوير حتى تنغمر العدسة الصوتية في الماء منزوع الأيونات، وقم بإزالة الفقاعات المحتبسة تحت العدسة الصوتية. اضبط الليزر على وضع التشغيل بالقدح الخارجي وابدأ عملية المسح التجريبي. اضبط الموضع Z لرأس التصوير حتى يستقر البؤران البصري والصوتي في منتصف الأذن.

قم الآن بضبط معاملات المسح وبدء عملية الحصول على الصور بشكل رسمي. لقياس التركيز الكلي للهيموجلوبين، اضبط الطول الموجي عند نقطة تساوي الامتصاص (isobestic point) حيث يتساوى معامل الانقراض المولي للأوكسي هيموجلوبين (oxyhemoglobin) والديوكسي هيموجلوبين (deoxyhemoglobin).

لقياس درجة تشبع الهيموغلوبين بالأكسجين، اضبط الطول الموجي الثاني عند النقطة التي يكون فيها هناك فرق واضح بين معاملات الامتصاص المولية للأكسي-هيموغلوبين والديكسيو-هيموغلوبين. وعند الانتهاء، قم بتنظيف أذن الفأر وضعه في حضانة. ومع ضبط درجة الحرارة البيئية عند 37 °C، وبمجرد استيقاظ الفأر، أعِده بشكل طبيعي إلى منشأة تربية الحيوانات.

تُظهر صورة إسقاط السعة القصوى هذه التشريح الوعائي لأذن فأر عارٍ حي تم تصويره باستخدام oPAM عند 570 نانومتر. وتُظهر صورة الإسقاط هذه تشبع hemoglobin بالأكسجين في الأذن نفسها، حيث يتم حسابها من الصور المكتسبة عند طول موجي متساوي القيمة (isosbestic) يبلغ 570 نانومتر وطول موجي سائد لامتصاص deoxyhemoglobin يبلغ 561 نانومتر.

يظهر الفحص الدقيق للمنطقة المؤطرة دقة التصوير الضوئي المقطعي بدقة ميكرونية (oramm)، حيث تظهر شبكة شعيرات دموية متراصة بكثافة وبوضوح تام. لقد استعرضنا في هذا الفيديو البروتوكول التجريبي النموذجي لتقنية التصوير الضوئي المقطعي بدقة ميكرونية (ORPM)، بما في ذلك تكوين النظام، ومحاذاة النظام، والإجراء التجريبي داخل الجسم الحي، ومخطط التصوير الوظيفي.

يُعد المحاذاة البؤرية الضوئية الصوتية أحد أهم الجوانب في تصميم الجهاز وتشغيله، وهي أمر بالغ الأهمية لحساسية التصوير والدقة البصرية. ويعد المجهر الصوتي الضوئي، بالاشتراك مع المجهر الصوتي الضوئي ذو الدقة الصوتية النافذة بعمق والتصوير المقطعي الصوتي الضوئي، واعداً في التصوير الوظيفي والجزيئي داخل الجسم الحي وعلى مقاييس نهائية متعددة؛ حيث يمكن تصوير الأجسام بدءاً من الخلايا والأنسجة وصولاً إلى الأعضاء بنفس التباين. وتملك هذه القدرة على التوسع في التصوير إمكانية إحداث ثورة في أبحاث الأنظمة البيولوجية متعددة المقاييس والبحوث الانتقالية، بدءاً من الاكتشافات المخبرية المجهرية وصولاً إلى الممارسة السريرية العيانية.