حل غاية intravital المجهري مخطط في الإضاءة مراكز جرمينال

الهدف العام من هذا الإجراء هو إعداد مجهر قياسي ثنائي الفوتون للتصوير الحيوي عالي الدقة. يتم تحقيق ذلك عن طريق محاذاة المجهر أولا ، والذي يتضمن ضبط الليزر. بعد ذلك ، يتم محاذاة مضاعف الشعاع لتحقيق شكل شعاع مثالي وترتيب مضاء بالشعاع.

في حالة المسح الضوئي متعدد الحزم ، يتم الحصول على الصور الأولية عن طريق مسح العينة بنمط الإضاءة المخطط. أخيرا ، يتم تطبيق خوارزمية لحساب الصورة النهائية عالية الدقة. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري للإضاءة المخططة لإظهار تفاصيل سلوك الجهاز المناعي داخل المراكز الجرثومية في الغدد الليمفاوية للفئران ، والتي كان يتعذر الوصول إليها سابقا من خلال الفحص المجهري الحيوي.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الإضاءة الهيكلية أو الفحص المجهري للتوطين ، هي أنه يمكن تطبيقها في أعماق أنسجة كبيرة في العينات الحية. لا يتطلب أي تعديل لشكل شعاع الليزر ، وبالتالي الحفاظ على الطريقة بسيطة للغاية وسهلة التنفيذ لأي مجهر متعدد الفوتونات. يظهر هنا الإعداد المستخدم للفحص المجهري للإضاءة المخططة ثنائية الفوتون متعددة الحزم لتحقيق الدقة المثلى وجودة التباين مع أدنى مستوى من تبييض الصور وأسرع اكتساب.

ضع في اعتبارك إجراء تعديلات على الإعداد كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد إجراء التعديلات ، تأكد من وصول الشعاع مرة أخرى إلى المرآة الموجودة مباشرة فوق مرآة الدخول في نهاية ضاغط النبض القائم على المنشور. بعد ضبط مسار الضوء من هنا ، ينعكس الشعاع في مضاعف الشعاع.

في حالة إجراء إضاءة مخططة متعددة الحزم ، قم بإجراء فحص مجهري متعدد الفوتون مع إيقاف تشغيل الماسح الضوئي. قم بمحاذاة المرايا في مضاعف الشعاع عن طريق وضع عينة فلورية متجانسة على المسرح وتركيز شعاع الليزر داخل العينة ، ولكن بالقرب من السطح العلوي. قريب من العدسة الأمامية للأهداف.

اضبط المجهر على الوضع متعدد الحزم واختر عدد الحزم والاستقطاب. على سبيل المثال ، P للعثور على شعاع الليزر عن طريق تصوير شريحة الفلورسنت ، اضبط مصراع P مفتوحا وقم بتشغيل كاميرا CCD بشكل مستمر أثناء تركيز الشعاع ، مما يضمن وجوده في الموضع المركزي. عند محاذاة شعاع P ، قم بالتبديل إلى وضع 64 شعاعا وافتح الغالق المقابل.

تحقق من موضع الحزمة. ضبط مرايا مضاعف الإرسال من الأولى إلى الخامسة ، مما يضمن أن مصابيح الشعاع بعيدة بشكل متساو. نظرا لأن خوارزميات الإضاءة المخططة تستند إلى هذا الافتراض ، فاستبدل عينة الفلورسنت بشكل موحد بالعينة غير المتجانسة.

على سبيل المثال ، عينة جذر منطقة Conval ومسح صورة متعددة الحزم. تأكد من أن الصورة تبدو واضحة وموحدة ومستقيمة. استبدل العينة غير المتجانسة بالعينة المتجانسة.

ابدأ تشغيل الماسح الضوئي XY للتحكم في عملية المسح. لإنشاء نمط إثارة الصورة المخططة للمسح الضوئي متعدد الحزم. حرك مرآة الماسحة الضوئية Y بشكل عمودي على خط الشعاع المضاء.

كرر النمط الذي تم إنشاؤه هنا المشار إليه بعدد الكتل عن طريق تحريك مرآة الماسح الضوئي X هنا تسمى إزاحة الكتلة لإنشاء صورة مخططة مستطيلة. ضع العينة غير المتجانسة مرة أخرى واستخدم الماسح الضوئي كمشغل رئيسي. قم بمزامنة الكاميرا مع الماسح الضوئي للحصول على صورة مخططة وحفظها تلقائيا للحصول على صور مخططة بشكل متكرر.

انقل مرآة الماسح الضوئي X إلى مواضع مختلفة عن طريق اختيار خطوات تكرار كافية هنا وعدد التحولات وطول الخطوة المناسب هنا. قم بتبديل الخطوة بين صورتين مخططتين لاحقتين لتغطية المسافة بين عرضين متتاليين للشعاع. اضبط التحول X على قيمة أقل من حد الدقة الجانبية عند الطول الموجي للإثارة المحدد.

على سبيل المثال ، يؤدي استخدام 10 خطوات من مرآة الماسح الضوئي X لكل نوبة و 12 أو 13 نوبة إلى أفضل دقة مكانية. النتائج باستخدام شريحة جذر منطقة conval لتحسين هاتين القيمتين حتى تصبح صورة منطقة conval الأكثر وضوحا. استخدم أداة ملف تعريف الخط على صور CCD التقليدية وصور الإضاءة المخططة المحسوبة.

قارن عرض ملفات تعريف الخط ، والتي في هذا المثال هي إشارة الفلورسنت من جدران الخلية الكونفالية. احصل على كل صورة مخططة خام متزامنة مع حركة الماسح الضوئي واحفظها بشكل منفصل ، على سبيل المثال ، في ملفات TIFF أو ملفات ثنائية. لإنشاء مصفوفة ثنائية الأبعاد لصورة الإضاءة المخططة عالية الدقة ، افتح مجموعة كاملة من الصور المخططة الخام كمصفوفات في روتين التقييم.

استخدم إما الحد الأدنى من الخوارزمية القصوى أو خوارزمية قائمة على تحويل فورييه كما هو موضح سابقا بالتفصيل لأداء الإضاءة المخططة ، والأشعة المتعددة ، والفحص المجهري متعدد الفوتون في الأنسجة العميقة. في الكائنات الحية ، تكتسب صورا مخططة في أعماق مختلفة للأنسجة بمرور الوقت وتقيمها كما هو موضح سابقا ، لإنشاء فيلم ثلاثي الأبعاد عالي الدقة للتفاعل الديناميكي بين المركز الجرثومي والخلايا البائية والخلايا المتغصنة المسامية. تتوافق أبعاد وظيفة انتشار النقطة الفعالة مع الدقة المكانية للمجهر.

قمنا بقياس هذه الوظيفة ثلاثية الأبعاد من خلال الحصول على إشارة توليد التوافقيات الثانية لألياف الكولاجين أو إشارة الفلورسنت لحبات البوليسترين 100 نانومتر المنبعثة عند 515 نانومتر في الغدد الليمفاوية ميون. باستخدام الإضاءة المخططة متعددة الحزم T-P-L-S-M مقارنة بتقنيتين للفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر الفوتون مثل الكشف الميداني T-P-L-S-M عن طريق كاميرات CCD وكشف النقاط T-P-L-S-M. من هذه القياسات ، يصبح من الواضح أنه على سطح العينة ، تتوافق كل من الدقة الجانبية والمحورية مع القيم المتوقعة التي تنبأت بها نظرية الحيود.

ومع ذلك ، مع زيادة عمق التصوير ، وبالتالي مع زيادة المسار البصري لكل من الإثارة والإشعاعات الانبعاثية من خلال وسط مع مؤشرات انكسار شديدة التباين ، تتدهور الدقة المكانية بشكل كبير بشكل مستقل عن الإعداد المستخدم. باستخدام M-B-S-I-T-P-L-S-M بشكل مستقل عن عمق التصوير ، وصلنا إلى دقة جانبية أفضل بنسبة 20٪ تقريبا ودقة محورية أفضل بنسبة 220٪. بالمقارنة مع مناهج T-P-L-S-M القياسية.

يعد الانتقاء النسيلي للخلايا البائية أثناء الاستجابة المناعية داخل الأعضاء اللمفاوية الثانوية للفئران البالغة الخطوة الأولى في طريقها للتمايز إلى خلايا الذاكرة البائية أو خلايا البلازما. في هذه العملية ، يعتقد أن التفاعل الديناميكي للغاية بين الخلايا المتغصنة المسامية والخلايا البائية على مستوى الهياكل المناعية المعقدة داخل المراكز الجرثومية يلعب دورا مركزيا. فقط باستخدام تقنية الفحص المجهري داخل الحيوية عالية التحليل ، يمكن تشريح هذا الاتصال الخلوي وآثاره على الاستجابة المناعية التي تظهر هنا كما هو موضح بواسطة مضاد CD 2135 FAB ATO five 90 على الخلايا المتغصنة المسامية.

يوفر M-B-S-I-T-P-L-S-M لأول مرة إمكانية التصور وتحديد أبعاد مجموعات الرواسب المناعية المعقدة بعمق يصل إلى 120 ميكرون في المراكز الجرثومية للغدد الليمفاوية المنفعية. توضح هذه الصور المقارنة المباشرة بين الصور المضان ثلاثية الأبعاد للرواسب المعقدة المناعية في مركز جرثومي كما تم الحصول عليها بواسطة PMT التقليدي القائم على M-B-S-I-T-P-L-S-M. علاوة على ذلك ، يمكن حل تفاعلات رواسب المركب المناعي مع الخلايا البائية المركزية الجرثومية بشكل كبير ويمكن الآن التحقيق فيها بالاشتراك مع المجسات الوظيفية الحيوية للتكاثر أو التمايز أو موت الخلايا المبرمج.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تضع في اعتبارك أنه باستخدام تقنية الكشف عن الكاميرا ، تكون سرعة الاستحواذ أعلى بثمانية أضعاف تقريبا ، في حين أن الحد الأقصى لعمق التصوير أقل بنسبة 25٪ تقريبا من تلك التي تم تحقيقها باستخدام مجهر متعدد الفوتون القياسي القائم على مضاعف الضوء. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد المجهر متعدد الطيات للعمل مع طريقة الإضاءة المخططة ، بما في ذلك ضبط مسار ضوء المجهر ، ومحاذاة خطوط الشعاع ، وحساب معلمات المسح ، وطرق حساب الصورة النهائية عالية الدقة. لتجارب الأنسجة العميقة داخل الحيوية.