وهناك طريقة بسيطة وفعالة لعزل تقوم البلاعم من الثقافات الابتدائية المختلطة من خلايا الكبد الكبار

الهدف العام من التجربة التالية هو الحصول على مزارع متعددة من الخلايا البلعمية من مزارع أولية مختلطة لخلايا كبد الجرذ دون الحاجة إلى معدات أو مهارات معقدة. ويتحقق ذلك أولاً من خلال تفكيك خلايا كبد الجرذ البالغ عن طريق تروية الكولاجيناز، يليه عزل جزء خلايا الكبد الحشوية. بعد ذلك، يتم تحضين الخلايا في دوارق زراعة الأنسجة T 75 مع وسط نمو لإنشاء مزارع أولية مختلطة من خلايا الكبد.

بعد ذلك، وبعد 10 إلى 12 يوماً من الزرع، تُرج دوارق الزرع لتسهيل نقل الخلايا البلعمية إلى أطباق بلاستيكية، حيث يتم حصادها بعد ذلك عن طريق الالتصاق الانتقائي بعد فترة حضانة قصيرة. وأخيراً، يمكن حصاد أكثر من 10 من الخلايا الست بشكل متكرر من نفس دوارق الزرع النسيجي T 75 بفواصل زمنية تتراوح بين يومين إلى ثلاثة أيام لمدة تزيد عن أسبوعين. لقد وُصفت طرق عزل الخلايا البلعمية الكبدية وصفاً دقيقاً.

ومع ذلك، تتطلب معظم الطرق السابقة معدات متطورة مثل جهاز الطرد المركزي الرأسي ومهارات تقنية دقيقة. نقدم هنا طرقاً بسيطة ومبتكرة للحصول على البلاعم الكبدية بعدد ونقاوة كافيين من المزارع الأولية المختلطة لخلايا الكبد البالغة، وهي طرق لا تتطلب معدات خاصة أو مهارات مختبرية متقدمة. سيقوم الأطباء Norco و Yamanaka و Miko yoshioka في المعهد الوطني لصحة الحيوان باستعراض عملية تشريح الحيوان، وتروية الكبد، وتحضير الخلايا.

بعد ذلك، سيقوم الدكتور Taketo Takeno من المعهد الوطني للعلوم الزراعية الحيوية بشرح كيفية عزل وتنقية البلاعم الكبدية من المخاطر الثقافية. لذا، فلنبدأ. للتحضير لعملية تروية كبد الجرذ، ابدأ بتسخين مسبق لزجاجة واحدة من محلول الغسيل وزجاجة واحدة من محلول الكولاجيناز.

بعد ذلك، وبعد التأكد من التخدير عن طريق قرصة الجلد، يتم وضع جرذ ذكر بالغ مُخدّر في وعاء من الفولاذ المقاوم للصدأ ورش 70%ethanol على منطقة البطن والصدر. بعد ذلك، يتم إجراء شق صغير في منتصف البطن باستخدام مقص التشريح وإزاحة الجلد للخلف. ثم يتم فتح البطن باستخدام المقص والتأكد من موقع الوريد البابي.

بعد ذلك، مرر الخيط الجراحي أسفل الوريد البابي وقم بشده بشكل فضفاض. ثم استخدم ملقط "موسكيتو" لغلق الجزء القاصي من الوريد الأجوف السفلي والوريد المساريقي لمنع ارتداد الدم إلى الكبد. افتح التجويف الصدري عن طريق قص الحجاب الحاجز بالمقص، وكشف القلب بعد إجراء شق صغير في الوريد البابي باستخدام مقص عيون، ثم أدخل قسطرة بلاستيكية بقطر 2 mm في الوريد وشد الخيط بإحكام حول القسطرة.

قم بتعبئة نظام التروية بمحلول الغسيل المسخن مسبقاً، ثم قم بتوصيله بالقسطرة. ابدأ عملية التروية في C two بمعدل 10 milliliters per minute. وفي الوقت ذاته، قم بإجراء قطع في جدار الأذين الأيمن باستخدام مقص التشريح.

استمر في عملية التروية لمدة 10 دقائق، ثم استبدل محلول التروية بمحلول الكولاجيناز وقم بالتروية لمدة تتراوح من 10 إلى 20 دقيقة. املأ كأساً معقماً بـ 25 milliliters من محلول الكولاجيناز بمعدل 10 milliliters في الدقيقة. بعد ذلك، قم بإزالة الكبد المروى ووضعه بعناية في الكأس.

قم بتقطيع الكبد إلى قطع صغيرة باستخدام المقص. أضف 75 milliliters من MEM البارد إلى معلق الخلايا الناتج. بعد عملية النقل بالماصة (pipetting) برفق، قم بترشيح المعلق من خلال مصفاة خلايا بقطر 100 micrometer.

لإزالة النسيج الضام من قطع الأنسجة غير المهضومة، يتم تجميع الرشاحة في أنابيب مخروطية سعة 50 milliliter. تُنقل الرشاحة إلى أنابيب مخروطية سعة 50 milliliter وتُغسل الخلايا أربع مرات عن طريق تدوير الخلايا أولاً بسرعة 50 Gs لمدة دقيقة واحدة عند درجة حرارة أربع درجات Celsius. مع إيقاف التدوير المفاجئ، يتم التخلص من السائل الطافي بعناية، ثم يُعاد تعليق الراسب في MEM بارد وتُدوّر الخلايا مرة أخرى بعد الغسلة الأخيرة.

أعد تعليق خلايا الكبد في وسط النمو. الآن، قم بتوزيع الخلايا في خمس إلى 10 دوارق زراعة أنسجة T 75 بكثافة 6.7 × 10⁴ خلية لكل سنتيمتر مربع. ضع دوارق المزرعة في حاضنة واستبدل وسط النمو كل يومين إلى ثلاثة أيام.

بعد يوم واحد من الزراعة، تنتشر الخلايا الكبدية المتنية على سطح القارورة وتظهر شكلًا نموذجيًا مضلعًا يشبه حجر الكوبال مع وجود نواة واحدة أو نواتين مستديرتين. وخلال أيام قليلة من الزراعة، تفقد الخلايا الكبدية المتنية شكل الخلايا الظهارية وتتحول إلى خلايا ليفية أكثر تسطحًا. وفي حدود اليوم السادس، تبدأ خلايا تشبه البلاعم، وهي خلايا مستديرة ومضيئة عند فحصها بالمجهر تبايني الطور، في التكاثر فوق طبقة الخلايا الليفية. ويصل نمو الخلايا الشبيهة بالبلاعم إلى أقصى مستوياته في حدود اليوم 12.

ينخفض عدد الخلايا الشبيهة بالبلعميات في اليوم 19 تقريباً عندما تبدأ طبقة الخلايا الليفية في التحلل. لذا، وبعد حوالي سبعة إلى 10 أيام من الزرع، نقوم بتعليق البلعميات التي تكاثرت على الطبقة الخلوية في وسط الزرع عن طريق رج دوارق الزرع بشكل تبادلي لمدة 30 دقيقة بعد إعادة تعليق البلعميات. يتم ملء كل طبق بلاستيكي بقطر 100 مليمتر (غير مخصص لزراعة الأنسجة) بالوسط المستخلص من قارورتين من نوع T 75.

أعد ملء دوارق الزرع بوسط النمو وأعدها إلى الحاضنة. قم بتحضين الأطباق البلاستيكية لمدة 30 دقيقة بعد فترة التحضين، واغسل الأطباق ثلاث مرات عن طريق سحب الوسط وشطف الطبق البلاستيكي برفق باستخدام PBS كما هو موضح هنا؛ ففي وقت مبكر يصل إلى 10 دقائق بعد زراعة الخلايا، تلتصق الخلايا الشبيهة بالبالعات بسطح الطبق بينما تظل الخلايا الليفية الملوثة الأخرى معلقة. بعد الشطف بـ PBS، يتم الحصول على مجموعة نقية للغاية من البالعات.

كما يظهر في هذا الشكل، تكتسب الخلايا المورفولوجيا النموذجية للخلايا البلعمية بعد 40 دقيقة من الزرع، ويُلاحظ تكرار وجود خلايا في مرحلة الانقسام الفتيلي كما تشير الأسهم. ولجمع هذه المجموعة الجديدة من الخلايا البلعمية عالية النقاوة، أضف 1 mL من محلول trip LE Express إلى الخلايا المغسولة وأعد الأطباق إلى الحاضنة لمدة 10 دقائق إضافية. بعد فترة الحضن هذه، أضف 9 mL من وسط النمو، ثم اكشط الخلايا البلعمية الملتصقة برفق باستخدام كاشطة الخلايا وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 mL، ثم قم بالطرد المركزي وتخلص من المادة الطافية.

أضف 1 mL من وسط النمو، وقم بتفكيك تجمعات الخلايا المعاد تعليقها إلى خلايا مفردة عن طريق الماصة بقوة، ثم قم بتعداد عدد الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer) كما هو موضح في هذا الرسم البياني، حيث يمكن حصاد أكثر من 10^6 من الخلايا من قارورة زراعة T 75 بشكل متكرر على فترات تتراوح بين يومين إلى ثلاثة أيام لمدة تزيد عن أسبوعين، مما يتيح إنتاجاً إجمالياً للخلايا يصل إلى 10^7 لكل قارورة زراعة T 75. وكما يظهر في هذه الصور، تم صبغ الخلايا المعزولة مناعياً باستخدام أجسام مضادة أحادية النسيلة ضد مستضدات البلاعم في الجرذان مثل CD 68 أو ED 1 و CD 1 72 A أو OX 41. وتمتلك هذه الخلايا خصائص وظيفية للبلاعم مثل البلعمة النشطة للخرزات المجهرية الموصومة بـ FITC.

قدمنا في هذا الفيديو طريقة بسيطة وفعالة للحصول على البلاعم من مزارع أولية مختلطة لخلايا الكبد الحمراء البالغة. لا يتطلب الإجراء الخاص بنا معدات أو مهارات معقدة، ولكنه يوفر أعداداً كافية من البلاعم النقية التي يمكن حصادها بشكل متكرر من نفس مزرعة الـ brass. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أنواع أخرى من الثدييات.

نشكركم على مشاهدة هذا الفيديو، ونتمنى لكم التوفيق في تجاربكم المستقبلية. مع أطيب التحيات.