عزل وتوصيف وتنقية الضامة من الأنسجة المتضررة من التهاب المتصلة بالسمنة

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل وتوصيف البلاعم بشكل فعال من الأنسجة التي تتأثر عادة بالالتهاب الناجم عن النظام الغذائي مثل الكبد. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات المناعة والالتهابات حول كيف يمكن للنمط الظاهري للبلاعم المقيم في الأنسجة أن يملي تطور الأمراض الالتهابية المزمنة. الميزة الرئيسية لذلك هي أن الإجراء يحسن خطوات العزل اللازمة للحصول على معلقات أحادية الخلية مشتقة من الأنسجة المتأثرة بالالتهاب المزمن منخفض الدرجة بوساطة السمنة.

ستظهر الإجراء جوزلين ألين ، طالبة دراسات عليا من مختبري. لعزل الكبد ، ضع أولا فأرا مبللا بالإيثانول في وضع ضعيف على لوح تشريح رغوة البوليسترين وقم بتأمين الكفوف الأمامية والخلفية. بعد ذلك ، استخدم ملقطا متوسط النقطة للإمساك بجلد البطن بالقرب من فتحة مجرى البول واستخدم مقصا حادا لتشريح لعمل شق صغير في الجلد المرتفع.

أدخل الشفرة السفلية من المقص في الشق بين الجلد والصفاق وقم بعمل شق جانبي من الفخذ إلى الذقن. اسحب الجلد برفق للخلف لكشف التجويف البريتوني السليم والجدار الصدري وعمل شق جانبي عبر الصفاق. ارفع القص وشق الحجاب الحاجز بعناية.

ثم حرك أعضاء الجهاز الهضمي إلى الجانب وحدد موقع الوريد الأجوف السفلي تحت الكبد أو IVC. باستخدام ملقط مرقئ ، قم بتثبيت IVC فوق الهيباتيك للحفاظ على التروية الموضعية وإرفاق حقنة مملوءة بمحلول نضح مسخن مسبقا بمجموعة جمع الدم والتسريب قياس 23. اضغط برفق على المكبس حتى تمتلئ الأنبوب والإبرة بمحلول التروية وأدخل الإبرة الموازية ل IVC تحت الكبد.

يضمن القنية المناسبة ل IVC توزيع المخزن المؤقت للتفكك محليا في جميع أنحاء الكبد والأنسجة الطرفية مما يحسن هضم الأنسجة. استخدم مشبك مرقئ بطول أربعة سنتيمترات لتثبيت الإبرة في مكانها واضغط برفق على المكبس لبدء التروية. إذا تم وضع الإبرة بشكل مناسب ، فسوف يتدفق اللون بسرعة من الكبد وستتضخم الفصوص.

قم بقطع الوريد البابي على الفور للسماح للعازلة بالتروية بالتدفق بحرية عبر الكبد ، وأحيانا قم بتدليك الفصوص برفق بين الإبهام والسبابة لتسهيل إزالة الدم. عندما يتبقى خمسة ملليلتر فقط من المحلول المؤقت للتروية ، استبدل حقنة التروية العازلة بحقنة مملوءة بمخزن مؤقت للتفكك الدافئ مسبقا ، واستمر في تدليك الفصوص بلطف وتخلل الكبد حتى يتم هضمه بالكامل. تأكد من نجاح الهضم عن طريق الضغط برفق على الحافة الحادة لزوج من الملقط في الفص الجانبي الأيسر.

يجب أن تظهر مسافة بادئة على السطح تمتلئ ببطء بمجرد إزالة الملقط. ثم قم بإزالة الإبرة واستخدم شفرة مستقيمة قصيرة من مقص تشريح لقطع الأربطة المتصلة بعناية لاستئصال الكبد بالكامل والمرارة. انقل الكبد إلى طبق بحجم 10 سم يحتوي على 10 ملليلتر من DMEM المثلج البارد واستخدم ملقطا مسننا لإمساك IVC فوق الهيباتيك المقطوع.

باستخدام ملقط متوسط النقطة ، قم بتطبيق حركة تمسيد سريعة على كل فص لتحرير الخلايا من كبسولة Glisson وتمرير DMEM المشبع عبر مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي 50 مليلتر على الجليد. لا يمكن تحقيق عوائد عالية من الخلايا القابلة للحياة إلا من خلال فصل خلايا الكبد بشكل صحيح عن كبسولة جليسون. عندما يتم جمع جميع الخلايا ، اقلب الأنبوب لخلط معلق الخلية برفق وحبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

انقل المادة الطافية إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مليلتر لثلاثة أجهزة طرد مركزي منخفضة الدوران. بعد الطرد المركزي الأخير ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 50 مليلتر وقم بالطرد المركزي للخلايا مرة أخرى بسرعة أعلى. ثم قم بإعادة تعليق حبيبات الخلية غير المتني في المخزن المؤقت FACS لعد خلايا الكبد وتخفيفها إلى التركيز المناسب وفقا لتطبيقها في أنابيب البوليسترين المستديرة القاع ذات السعة خمسة ملليلتر.

تظهر الفئران التي تتغذى على نظام غذائي غني بالدهون أو نظام غذائي عالي الكوليسترول زيادة في تسلل الضامة M1 المنشطة بشكل كلاسيكي في الأنسجة المصابة مثل الشريان الأورطي. تنخفض مستقبلات RON التي تعبر عن البلاعم الإيجابية الأبهري CD45 الإيجابية F4 / 80 والتي تظهر نمطا ظاهريا مضادا للالتهابات في الفئران التي تتغذى على نظام غذائي عالي الكوليسترول عالي الدهون بينما تم العثور على البلاعم الإيجابية CD45 الإيجابية F4 / 80 الإيجابية CD11c المؤيدة للالتهابات بأعداد متزايدة في الشريان الأورطي المعزول من هذه. علاوة على ذلك ، يظهر مستقبل RON المصنف الذي يعبر عن البلاعم المشتقة من الشريان الأورطي المهضوم تعبيرا متزايدا عن جين Arginase 1 ، وهو علامة M2 راسخة.

في الواقع ، يكشف توصيف البلاعم المقيمة في الكبد عن النمط الظاهري السائد لمستقبلات RON التي تعبر عن مجموعات سكانية فرعية مع مجموعات البلاعم المؤيدة للالتهابات CD11c مما يدل على انخفاض التعبير عن الجينات المرتبطة ارتباطا وثيقا بالنمط الظاهري M2 المضاد للالتهابات. لوحظت اتجاهات مماثلة في مجموعات البلاعم المعزولة من الأنسجة الدهنية البيضاء المهضومة مع مجموعات البلاعم ذات النمط الظاهري المؤيدة للالتهابات التي تظهر انخفاضا في التعبير السطحي لمستقبلات RON. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في 20 إلى 30 دقيقة لكل إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل قياس التدفق الخلوي ، وفرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت ، و / أو تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي لتوصيف النمط الظاهري للضامة المعزولة المشتقة من الأنسجة المشتقة من الكبد. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل البلاعم المقيمة في الأنسجة بشكل صحيح عن الكبد المريض. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.