تحديد الهياكل الجزيئية لفيروس نقص المناعة البشرية جليكوبروتينات مغلف باستخدام البرد الكترون والتصوير المقطعي الآلي متوسط ​​الفرعية صورة مقطعية

أُصيب أكثر من 60 مليون فرد بفيروس نقص المناعة البشرية (HIV)، وهو الفيروس المسبب لمرض الإيدز. ويُعد مرض الإيدز الناتج عن فيروس نقص المناعة البشرية أزمة صحية عالمية، ورغم أن جهود البحث المكثفة قد ساهمت بشكل كبير في إطالة أعمار الأفراد المصابين، إلا أن الوصول إلى لقاح فعال لا يزال بعيد المنال. وينصب تركيز أساسي في أبحاث لقاح فيروس نقص المناعة البشرية على البروتين السكري الغلافي، الذي يستخدمه الفيروس لدخول الخلايا المستهدفة.

نوضح في هذا الفيديو كيفية الحصول على هياكل هذا البروتين الهام باستخدام تقنية تصوير تُسمى التصوير المقطعي الإلكتروني المبرد. بدءاً من فيروس HIV المنقى، نعرض خطوات تحضير العينات المجمدة، وخطوات تسجيل الصور المجهرية الإلكترونية لهذه العينات المجمدة، وخطوات تحويل هذه الصور إلى نماذج هيكلية يمكن أن تكون مفيدة في تصميم لقاح لمرض نقص المناعة المكتسبة (hiv aids). ويتمثل الجانب الفريد فيما نعرضه في هذا الفيديو في أن العمل سيتم استعراضه من قبل أعضاء مختبرها من مختلف الفئات العمرية، بدءاً من طلاب المرحلتين المتوسطة والثانوية، وصولاً إلى طلاب المرحلة الجامعية والدراسات العليا، ومن ثم زملاء ما بعد الدكتوراه والعلماء المتخصصين.

يتم تحضير عينات الفيروسات المُزجّجة المناسبة للتصوير المقطعي الإلكتروني المبرد عن طريق توزيع معلق مائي من الفيروسات عبر ثقوب صغيرة في غشاء كربوني مدعوم بشبكة نحاسية، ومن ثم تجميد الفيروسات بسرعة. والهدف من هذه الخطوة هو تحضير عينة مجمدة من الفيروسات السليمة التي تم التقاطها في حالة قريبة من حالتها الطبيعية. وللبدء، توضع الشبكات داخل وحدة تفريغ توهجي.

يقوم هذا الجهاز بتنظيف الشبكات عن طريق تعريضها لغاز متأين. والآن بعد أن أصبحت الشبكات جاهزة للاستخدام، يتم تحضير معلق من الفيروسات الممزوجة بجزيئات ذهبية صغيرة. وتعد هذه الجزيئات ضرورية لعملية جمع البيانات ومعالجتها.

بعد ذلك، يتم وضع قطرة من معلق الفيروس على الشبكة التي تم تنظيفها حديثاً بالبلازما. ثم يتم تحميل الشبكة في جهاز روبوت، والذي يقوم بتجفيفها باستخدام ورق ترشيح، مما يقلل القطرة إلى غشاء رقيق من السائل. ثم تُغمر العينة في الإيثان، مما يؤدي إلى تجميد الفيروسات بسرعة بمعدل يتجاوز 100,000 kelvin في الثانية.

تُنقل الشبكة المجمدة بالتجميد السريع بعد ذلك إلى صندوق تخزين لنقلها إلى المجهر. تُكرر هذه العملية حتى يتم تجميد العدد المطلوب من الشبكات. وبعد أن أصبحت شبكات عينات الفيروس جاهزة، فإن الخطوة التالية هي تحميلها في المجهر.

بالنسبة للتصوير، يمكن إجراء هذه العملية يدويًا أو بمساعدة روبوتية. فعند تحميل شبكات العينات يدويًا، يجلس المستخدم في محطة متخصصة حيث يمكن التعامل مع العينات تحت النيتروجين السائل، وتوضع العينات في غرفة محمولة مبردة بالنيتروجين يتم إغلاقها وتفريغها من الهواء، ثم تُربط بالمجهر. وتتميز المجاهر الأحدث بقدرتها على تحميل العينات بشكل أكثر أتمتة.

هنا في مجهر Titan Cryos، يقوم المستخدم بتسليم العينات المجمدة إلى المجهر، ثم يتم تحميل شبكات العينات آلياً داخل المجهر. ويمكن للمستخدم فحص كل شبكة قبل البدء في التصوير. يتم ضبط معلمات المجهر لكل منطقة في شبكة العينة تحتوي على سمات ذات أهمية.

في هذه الحالة، تكون السمات هي فيروسات HIV. ومع تحديد كل منطقة جديدة، يقوم كمبيوتر المجهر بتخزين معاملات التصوير الخاصة بتلك المنطقة. وعندما ينتهي المستخدم من تحديد جميع المواقع ذات الأهمية، يقوم الكمبيوتر بالرجوع إلى كل موقع تلقائيًا وجمع مجموعة من البيانات.

يتم جمع كل مجموعة بيانات عن طريق إمالة شبكة العينة بالنسبة لحزمة الإلكترونات، مع ضمان بقاء الحزمة مركزة على نفس النقطة في الشبكة. تطلبت عملية جمع البيانات في المجهر الإلكتروني تقليدياً من المستخدمين الجلوس أمام المجهر والتفاعل جسدياً مع المعدات. يظهر هذا النمط من التفاعل مع المجهر هنا خلال زيارة الرئيس أوباما لمصنع شركة إنتل.

تسمح التطورات الحديثة في واجهات الكمبيوتر الخاصة بالمجاهر الآن للمستخدمين بمراقبة وضبط عملية جمع البيانات في الوقت الفعلي من جهاز كمبيوتر عن بُعد داخل المختبر أو في أي مكان آخر. ومن أجل تصور أشكال الغلاف والنتوءات البروتينية السكرية، يجب حساب متوسط المعلومات المستمدة من مئات الصور الفردية لتعزيز الإشارة. وتعد هذه العملية كثيفة الحوسبة، ويتم إنجازها هنا باستخدام مجموعة من أجهزة الكمبيوتر تسمى Bio Wolf.

تم تطوير طرق قوية في معاهد الصحة الوطنية (NIH) لاستخراج أحجام فردية وحساب متوسط المعلومات باستخدام خوارزميات يمكنها العمل في ظل مستويات الضوضاء العالية. وتوفر خرائط الكثافة المستمدة من كل من الفيروسات الأصلية والفيروسات المرتبطة بجزيئات ذات أهمية بيولوجية، وهو أمر متأصل في هذا النوع من البيانات، قاعدة بيانات غنية بالمعلومات حول البيولوجيا البنيوية لفيروس HIV. وتكتسب خرائط الكثافة تفاصيل جزيئية دقيقة عندما يتم دمج البيانات مع المعلومات المستمدة من بلورات الأشعة السينية للوحدات الفرعية الفردية التي تشكل بروتين الغلاف السكري الشوكي.

يمكن أن تكون البيانات الناتجة عن هذه التصاوير المقطعية كثيفة للغاية ويصعب تفسيرها. لذا، يمكن استخدام برمجيات التصميم ثلاثي الأبعاد المخصصة لصناعة الترفيه لتجسيد النماذج ثلاثية الأبعاد من خلال إضافة الألوان والقوام والإضاءة، مما يجعل تحليلها أكثر سهولة. ومن برمجيات التجسيم الشائعة الاستخدام Mirror 3D Studio Max و Maya.

لقد عرضنا للتو إجراءات تفصيلية خطوة بخطوة حول كيفية الحصول على نماذج جزيئية لبنية البروتين السكري للغلاف، بدءاً من فيروس HIV المنقى. وباستخدام هذه الطريقة، قمنا أيضاً بتحديد بنيات البروتين السكري للغلاف في معقدات مع مجموعة متنوعة من الجزيئات التي يمكنها الارتباط بالفيروس واستغلاله.

نعرض هنا مثالاً لبنية البروتين السكري للغلاف في معقد مع جسم مضاد يسمى B12. إن فهم سبب قدرة بعض الجزيئات على الارتباط بالفيروس واستخدامه بينما لا تستطيع جزيئات أخرى ذلك أمر بالغ الأهمية للتصميم العقلاني للقاحات. ويعد تحديد البنى الجزيئية للبروتينات السكرية للغلاف من فيروس HIV أو من فيروسات أخرى، مثل الإنفلونزا وإيبولا، مفتاحاً لفهم عملية دخول الفيروس واستخدامه.

كما رأيتم، بدأت تقنية التصوير المقطعي الإلكتروني المبرد (cryo-electron tomography) تظهر الآن كأداة قوية لتحقيق هذا الهدف.