اكتشاف اكسيد النيتريك وانيون الراديكالي فوق الأكسيد بواسطة الكترون ممغطس التحليل الطيفي بالرنين من الخلايا باستخدام الفخاخ سبين

أنا فريدريك دينا، أستاذ مشارك في علم الأدوية هنا في جامعة ولاية أوهايو. سنقوم في هذا العرض التوضيحي بشرح كيفية الكشف عن أكسيد النيتريك والسوبر أكسيد من الخلايا باستخدام تقنية EPR Spin Trapping.

ترتبط أنواع الأكسجين والنيتروجين التفاعلية بنشوء أمراض مختلفة، ولذلك تكتسب عملية الكشف عنها في الأنظمة البيولوجية أهمية قصوى. وقد استُخدمت طرق موثوقة قليلة فقط للكشف عن الأنواع التفاعلية في الأنظمة البيولوجية، إلا أنها تظل محدودة من حيث النوعية والحساسية. ومع ذلك، يشيع استخدام طريقة إسقاط الغزل (Spin dropping) لتحديد أنواع الأكسجين التفاعلية، وتتضمن تفاعل إضافة الجذور الحرة إلى مصيدة غزل نيتروجينية أو معقدات معدنية لتكوين ناتج إضافة غزل مستمر، والذي يمكن الكشف عنه بواسطة مطيافية الرنين البارامغناطيسي الإلكتروني أو EPR، حيث تظهر نواتج إضافة الجذور المختلفة طيفاً مميزاً يمكن استخدامه لتحديد الجذور المتولدة، كما يمكن أن توفر هذه الطريقة معلومات وافرة حول طبيعة وحركية إنتاج الجذور الحرة.

يعمل إنزيم سينثاز أكسيد النيتريك على تحفيز تحويل L-arginine إلى L citruline باستخدام N-A-D-P-H لإنتاج أكسيد النيتريك. وفي ظروف الإجهاد التأكسدي، يمكن أن يتحول الإنزيم من إنتاج أكسيد النيتريك إلى إنتاج السوبر أكسيد في عملية تسمى "فك الارتباط" (uncoupling)، والتي يُعتقد أنها ناتجة عن أكسدة الهيم أو العامل المساعد الذي يتدخل في تنظيم أكسيد النيتريك. ويُعد تنظيم أكسيد النيتريك في الأنظمة البيولوجية أمرًا بالغ الأهمية نظرًا للدور الجوهري الذي يلعبه في نقل الإشارات الخلوية، مما يؤدي إلى وظائف فسيولوجية مفيدة مثل توسع الأوعية الدموية، إلا أن الإفراط في إنتاجه غالبًا ما يرتبط بحالات التهابية. لذا، فإن الكشف عن أكسيد النيتريك في الأنظمة البيولوجية يكتسب أهمية كبيرة.

تعد أنواع الأكسجين التفاعلية مثل أكسيد النيتريك فئة أخرى مهمة من جزيئات الإشارة في الأنظمة البيولوجية؛ إذ تلعب أنواع الأكسجين التفاعلية بتركيزات منخفضة دوراً هاماً في تنظيم وظائف الخلية، والإشارة، والاستجابة المناعية، ولكن في التركيزات غير المنظمة يمكن أن تؤدي إلى تلف تأكسدي خلوي يؤدي بدوره إلى الإجهاد التأكسدي. ويعد أنيون جذور السوبروكسيد أحد أهم أنواع الأكسجين التفاعلية، وهو السلف الرئيسي لبعض أكثر الأنواع أكسدة المعروفة بوجودها في الأنظمة البيولوجية مثل نيتريت السوبروكسيد وجذر الهيدروكسيل. لذا فإن الكشف عن السوبروكسيد و/أو عزله في النظام البيولوجي أمر مهم، لأن توليده يمثل أول إشارة على حدوث الدفق التأكسدي قبل بدئه.

يعتمد هذا البروتوكول على استخدام التريبسين لفصل خلايا بطانية شريانية بقرية مستنبتة كما هو موضح في الإجراء المكتوب. انقل الخلايا إلى طبق بستة آبار مُصنفة، ثم قم بتحضينها طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5%CO2 بعد عملية التحضين.

أخرج الصفيحة ذات الستة آبار من الحاضنة، ثم اسحب الوسط من البئر الأول. اغسل الخلايا مرتين باستخدام 1 mL من محلول منظم فوسفات ملحي (DPBS). حضّر محلول كبريتات الحديدوز سباعي الهيدرات بتركيز 1.9 mM عن طريق إضافة 0.8 mg من كبريتات الحديدوز إلى 1 mL من محلول DPBS المحتوي على كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم.

قم بتحضير محلول MGD عن طريق إضافة 2.7 milligrams من ammonium MGD إلى 500 µL من DPBS المحتوي على calcium chloride وMagnesium chloride. أضف 210 µL من iron sulfate hep dehydrate بتركيز 1.9 millimolar المحضر حديثاً، و210 µL من MGD المحضر حديثاً باستخدام نسبة مولارية تبلغ واحد إلى سبعة، ثم اخلط المعلق الناتج. أضف 4.6 µL من calcium ion four واخلط المحلول مرة أخرى عن طريق السحب والطرد باستخدام الماصة.

بعد ذلك، يتم تحضين العينة عند 37 °C لمدة 36 دقيقة. يتم جمع الطافي المترسب في أنبوب إبندورف. أدخل معايير اكتساب EPR: مجال مركزي قدره 34.27 gauss، وسعة تعديل قدرها 6 gauss، وتردد قدره 9.8 GHz.

نظرًا لأن المعايير ستختلف من جهاز وظروف تجريبية إلى أخرى، يرجى مراجعة النص لمعرفة المعايير الأخرى المستخدمة في هذا الجهاز. انقل المادة الطافية إلى خلية EPR مسطحة وأغلقها بإحكام باستخدام البارافين ثم ضعها في تجويف EPR. سجل الأطياف لمدة 21 دقيقة تقريبًا بـ 121 مسحًا وبمعدل 10.4 ثانية لكل مسح بعد تشغيل التجربة.

استخدم برنامج brucker WIN EPR لمعالجة البيانات من أجل تصحيح خط الأساس وتكامل الأطياف ثنائية الأبعاد (2D spectra)، مما يقلل من ضوضاء الخلفية. وتجدر الإشارة إلى أن وقت المسح وعدد المسوحات قد يختلفان من تجربة إلى أخرى. كما يمكن أن تختلف طرق تصحيح خط الأساس أيضاً من برنامج إلى آخر.

لبدء فك ارتباط Enos، قم بإزالة الوسط من البئر الثاني في لوحة الستة آبار واغسل الخلايا مرتين باستخدام 1 mL من DPBS. بعد ذلك، أضف 100 µL من محلول Syn one المُحضّر بتركيز 0.5 mM، وأكمل الحجم إلى 2 mL باستخدام DPBS المحتوي على 10% FBS، ثم قم بحضن الخلايا لمدة ساعتين عند 37 °C و5% CO2 بعد عملية الحضن.

اغسل الخلايا باستخدام DPBS مرتين. ثم أضف 210 µL من كبريتات الحديد سباعية الهيدرات بتركيز 2.8 mM المحضرة حديثًا، و210 µL من MGD بتركيز 19.6 mM المحضر حديثًا وفقًا للإجراء السابق. بعد ذلك، أضف 4.6 µL من أيون الكالسيوم بتركيز 1.9 mM، ثم اخلط المحلول مرة أخرى.

كما في السابق، يتم تحضين الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 36 دقيقة. وبعد مرور 36 دقيقة، يتم جمع السائل الطافي المترسب في أنبوب إبندورف ونقله إلى خلية EPR مسطحة. يتم تسجيل أطياف EPR باستخدام نفس معلمات الاستحواذ السابقة باتباع إجراءات الاستحواذ.

قم بمعالجة البيانات بنفس الطريقة قبل البدء في هذا البروتوكول. قم بتحضير محلول مخزون من DMPO بتركيز 1 molar ومحلول PBS يحتوي على 0.1 millimolar من DTPA. بعد ذلك، قم بتحضير محلول بتركيز 1 milligram per milliliter من 4 by 12.

قم بإعداد حصص قدرها 1 mL من المحلول المخزن لـ PMA في DMSO عن طريق تخفيفه ليصل تركيزه إلى 10 µg/mL في محلول PBS داخل أنبوبة Eppendorf تحتوي على 1 mg/mL من D-glucose و 1 mg/mL من الألبومين. جهز تركيزاً يتراوح بين 5 إلى 6 ملايين خلية PMN لكل 1 mL عن طريق السحب والضخ باستخدام الماصة في أنبوبة Eppendorf سعة 1.5 mL. حضّر خليطاً بحجم نهائي قدره 60 µL يحتوي على 1.6 × 10⁶ خلية تقريباً من PMN و 10 mM من DMPO و 0.2 µg/mL من PMA.

في هذه التجربة، سنستخدم مطياف Bruker ESP 300 X band. انقل المحلول إلى خلية EPR مسطحة، ثم ضع الخلية المسطحة في تجويف EPR. أدخل معاملات اكتساب EPR بحيث يكون المجال المركزي 3, 486 goss وسعة التعديل 0.5 goss، والتردد 9.8 gigahertz.

نظراً لأن المعايير تختلف من جهاز لآخر ومن ظروف تجريبية لأخرى، يرجى مراجعة النص لمعرفة المعايير الأخرى المستخدمة في هذه التجربة لجمع الأطياف. في هذا العرض التوضيحي، نبين الكشف عن أكسيد النيتريك وجذور SU peroxide باستخدام مصيدتين دورانيتين مختلفتين، وهما iron MGD وDNPO.

نوضح أن تحفيز الخلايا البطانية بـ calcium ion four ينتج أكسيد النيتريك، وأن المعالجة بـ seen one، وهو مانح لـ perine nitrite، يمكن أن تقلل من إنتاج أكسيد النيتريك؛ ومع ذلك، فإن تحفيز الخلايا المتعادلة باستخدام PMA في وجود nitro spin trap ينتج جذراً هيدروكسيلياً ADDA بدلاً من S oxide نظراً لعدم استقرار superoxide adda المتكون أولياً. وبينما تظل آليات spin trapping بواسطة iron mg d nitros متماثلة أساساً، فإن إضافة أكسيد النيتريك إلى iron MGD تتضمن pass rate of reaction، وأن شكل iron MGD nitric oxide add يكون مستقراً للغاية.

في الواقع، يمكن تجميد المحلول عند درجة حرارة 80- °C للحصول على طيف EPR لاحقاً دون حدوث انخفاض ملحوظ في شدة إشارة EPR. ومن ناحية أخرى، فإن الكشف عن الأكسيد باستخدام مصيدة الغزل النيتروجينية يكون بطيئاً، مما يتطلب تركيزات أعلى من مصيدة الغزل مقارنة بنظيرتها MGD four للكشف عن أكسيد النيتريك.

تم توظيف عدة مقاربات للكشف بنجاح عن شكل ناتج إضافة السوبر أكسيد، وهو ما لم نقم بتوضيحه أكثر في هذا الفيديو. فعلى سبيل المثال، يمكن أن يؤدي استخدام الخلية المسطحة إلى الحصول على شدة إشارة أفضل لناتج إضافة السوبر أكسيد نظراً لكثافة الخلايا الأعلى. لذا أشجعكم على الرجوع إلى النص بخصوص هذا الشأن.

علاوة على ذلك، وبدلاً من استخدام DMPO، يمكن توظيف مصيدة سبين معتمدة مثل BMPO و VMP أو Nitro DAP MPO المفسفر، والتي يمكن أن تعطي نواتج إضافة بيروكسيد SU أكثر استدامة. كما تم استخدام السيكلوديكسترين لتثبيت نواتج إضافة بيروكسيد SU عند استخدام تقنية مصيدة السبين للكشف عن US. ويوصى بشدة بالحصول الفوري على طيف EP بعد توليد سوبر أكسيد SU.

وبناءً على ذلك، فإن الكشف عن أكسيد النيتريك باستخدام iron MGD يعد أكثر كفاءة بكثير، والتحدي الرئيسي الذي يواجه الآن عملية spin trapping للـ superoxide باستخدام PR هو تحقيق الخصائص التي لوحظت في تكوين iron MGD nitric oxide addoch. وهي التفاعلية السريعة مع superoxide وتكوين add مستقر. وتجري الآن جهود في مختبرنا وفي مجموعات أخرى لتطوير spin traps تتميز بتفاعلية سريعة تجاه superoxide وتكوين spin مستقر. ADD.