قياس نشاط رابطة الدول المستقلة عناصر التنظيم في الشبكية بواسطة الماوس Electroporation يزدرع

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء التثقيب الكهربائي لغرسات شبكية الفأر باستخدام مراسلين نسخيين فلوريين وقياس مستويات تعبيرهما. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق عزل أنسجة شبكية الفأر حديث الولادة عبر عملية التشريح. أما الخطوة الثانية من الإجراء فهي إجراء التثقيب الكهربائي للشبكية باستخدام بنى DNA مراسلة فلورية.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في استزراع الشبكيات التي خضعت للتثقيب الكهربائي كطعوم لمدة ثمانية أيام. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي حصاد الشريحة الشبكية المستأصلة وقياس مستويات تعبير المراسلين الفلوريين. وفي نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج تظهر مستويات التعبير النسبي لبنى مختلفة من مراسلي المحفزات في شبكية الفأر النامية من خلال التثقيب الكهربائي للشريحة المستأصلة، متبوعاً بتحليل البيانات الكمية.

اسمي جو كوربو، وأنا عضو في هيئة التدريس بقسم علم الأمراض والمناعة في كلية الطب بجامعة واشنطن في سانت لويس. وسنعرض اليوم بروتوكولاً مرئياً يوضح تقنية التثقيب الكهربائي للأنسجة المستأصلة من شبكية العين في فئران حديثي الولادة، وذلك بهدف قياس نشاط العناصر التنظيمية لـ CYS النوعية للمستقبلات الضوئية، وستقوم سيندي مونتانا، طالبة الدراسات العليا في مختبري، بتوضيح هذا البروتوكول. أولاً، قم بتعقيم غرفة التثقيب الكهربائي وجميع الأدوات باستخدام 70%ethanol استعداداً لجمع العيون.

قم بتطهير كل من القفازات وسطح العمل باستخدام الإيثانول والحافظ على الظروف المعقمة طوال الإجراء. بعد ذلك، وباستخدام مصّة في غطاء زراعة الأنسجة، ضع 6 milliliters من وسط التشريح في طبق بتري معقم واحد بقطر 60 millimeter، و 3 milliliters من الوسط في طبقين معقمين بقطر 35 millimeter. وبالعودة إلى سطح العمل، قم بتطهير رأس ورقبة جرو فأر حديث الولادة باستخدام 70% ethanol.

بعد قطع الرأس بسرعة باستخدام مقص، انقل الرأس إلى طبق معقم بقطر 100 مليمتر، ثم قم بإزالة فروة الرأس باستخدام مقص صغير لكشف العينين تحت مجهر تشريحي. وباستخدام ملاقط منحنية، استخرج العين برفق من المحجر ثم ضعها في طبق بقطر 35 مليمتر يحتوي على وسط تشريح (dissection medium). استمر في جمع العيون بحيث تتوفر ثلاث إلى أربع عيون لكل حصة من DNA سيتم نقلها كهربائياً، مع الحفاظ على العيون ووسط التشريح في درجة حرارة الغرفة حتى الانتهاء.

قم بتطهير كل من شفرة الحلاقة وغلاف ماصة نقل بلاستيكية معقمة باستخدام ethanol 70%، ثم استخدم شفرة الحلاقة لقطع طرف الماصة بارتفاع كافٍ يسمح بنقل عين كاملة. وباستخدام الماصة التي تم توسيع فتحتها، انقل عيناً واحدة من الطبق الذي قطره 35 مليمتر إلى الطبق الذي قطره 60 مليمتر تحت مجهر تشريحي وبقوة تكبير عالية. استخدم ملقطاً دقيقاً لإزالة أي أنسجة من سطح العين، مثل العضلات خارج العين والدهون.

بعد ذلك، قم بإزالة العصب البصري عن طريق قرصه من القاعدة. ولعزل الشبكية، اصنع ثقباً صغيراً في الصلبة عند الحافة؛ حيث تظهر الصلبة والظهارة الصباغية للشبكية لامعتين مقارنة بنسيج الشبكية الذي يكون لونه رمادياً باهتاً. أدخل طرفاً واحداً من كل زوج من الملاقط في الثقب وقم بتمزيق الصلبة والظهارة الصباغية للشبكية بلطف.

تأكد من ترك العدسة في مكانها. استخدم الماصة ذات الفتحة الواسعة لنقل الشبكية المُشرحة إلى الطبق الثاني بقطر 35 millimeter والذي يحتوي على الوسط الغذائي. اجمع جميع الشبkiات واحفظها في حاضنة زراعة أنسجة عند درجة حرارة 37 degree Celsius.

قبل البدء في عملية التثقيب الكهربائي (electroporation) داخل غطاء زراعة الأنسجة، قم بملء طبق معقم بقطر 35 مليمتر بوسط التشريح وطبق ثانٍ بوسط الزراعة لكل حصة من الحمض النووي (DNA) سيتم تثقيبها كهربائياً. وباستخدام ماصة P 200، اغسل غرف طبق التثقيب الكهربائي بمحلول 1X PBS المعقم ثلاث مرات. ثم املأ الغرف بحصص الـ DNA التي تبلغ 60 ميكرولتر، واملأ أي غرف غير مستخدمة بـ 60 ميكرولتر من محلول 1X PBS.

قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بوعاء التثقيب الكهربائي وأدخل الإعدادات المناسبة في جهاز التثقيب الكهربائي. استخدم ملاقط دقيقة للإمساك بالشبكيات من ناحية العدسة ونقلها إلى غرف التثقيب الكهربائي، مع وضع ما يصل إلى أربع شبكيات في كل غرفة.

قم بترتيب الشبكيات بحيث تتكئ العدسة على القضيب المعدني المتصل بالقطب الموجب. امسح الملقط بين كل غرفة وأخرى لتجنب انتقال DNA من غرفة إلى التالية. بمجرد محاذاة جميع الشبكيات، اضغط على زر البدء في جهاز التثقيب الكهربائي.

يجب أن تتكون فقاعات صغيرة على القضيب المعدني المتصل بالقطب السالب. افصل الأقطاب الكهربائية وأوقف تشغيل جهاز التحليل الكهربائي باستخدام الملاقط. حرك الشبكيات بلطف بعيداً عن جدران الغرفة.

انقل الشبكيات من الغرف إلى أطباق بقطر 35 مليمتر تحتوي على وسط التشريح. وباستخدام ماصة نقل معقمة، انقل الشبكيات من وسط التشريح إلى أطباق بقطر 35 مليمتر تحتوي على وسط الزرع. قم بتمييز آبار لوحة زرع معقمة مكونة من ستة آبار، واملأ كل بئر بثلاثة مليلتر من وسط الزرع.

استخدم ملقطاً معقماً لتعويم مرشحات watman nucleo المستديرة فوق الوسط في كل بئر، بحيث يكون الجانب اللامع من المرشحات متجهاً للأعلى. وبمساعدة مجهر تشريحي، انقل شبكية واحدة إلى المرشح باستخدام ماصة نقل معقمة، مع توجيه جانب العدسة للأسفل. إذا استقرت الشبكية وجانب العدسة متجه للأعلى، اسحبها مرة أخرى إلى داخل الماصة وحاول مجدداً.

ضع ما لا يزيد عن أربع شبكيات في كل بئر مع الحفاظ عليها في قطرات منفصلة. وبمجرد وضع الشبكيات في الآبار، انقل طبق الزرع إلى حاضنة زراعة الأنسجة عند درجة حرارة 37 degree Celsius واتركها تنمو للمدة المطلوبة. وعادةً ما تؤدي عملية التثقيب الكهربائي الناجحة بعد ثمانية أيام كما هو موضح هنا إلى تعبير عن بنية DNA عبر ربع إلى ثلث سطح الشبكية.

يتم تقدير مستويات الفلورة من خلال مقارنة المناطق التي خضعت لعملية التثقيب الكهربائي بشكل موحد والتي تعبر عن بنية CRE بالمناطق الواقعة خارج الشبكية، ومن ثم إجراء عملية تطبيع مقارنة بتعبير GFP الضابط. وكما هو موضح، فإن المستقبلات الضوئية العصوية على وجه الخصوص يتم نقل الجينات إليها بكفاءة. وفيما يلي نتائج عملية تثقيب كهربائي يقوم فيها محفزان نوعيان للخلايا العصوية بتوجيه تعبير GFP وDS red في الطبقة النووية الخارجية.

من خلال مطابقة نمطي التعبير مع صبغ DPI الموضح هنا باللون الأزرق، يتضح التعبير النوعي في المستقبلات الضوئية. ولا يُلاحظ أي تعبير سواء في الطبقة الشفافة الداخلية أو طبقة الخلايا العقدية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تتكون لديك فكرة جيدة عن كيفية تشريح واستنبات مستأصلات شبكية الفأر لغرض قياس نشاط العناصر التنظيمية لسيتوستات الشبكية.

شكراً للمشاهدة، ومع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.