نقل الجينات إلى الأذن الداخلية عن طريق تطوير ماوس

قامت جين بالنقل إلى تطوير الأذن الداخلية للفأر عن طريق التثقيب الكهربائي في الجسم الحي، لينج وانج، وهان جانج، وجون بورغاندي، مركز أوريغون لأبحاث السمع، جامعة أوريغون للصحة والعلوم. حسنًا، اسمي جون بورغاندي. مختبري موجود في مركز أوريغون لأبحاث السمع في جامعة أوريغون للصحة والعلوم.

اسمي أنج. أنا باحثة ملصقات في مختبر جونز. أنا أنج أيضاً في مختبر جونز كمساعدة أبحاث.

ينقسم عرضنا التوضيحي إلى أربعة أجزاء. الجزء الأول هو عملية فتح البطن من الناحية البطنية. حيث نستعرض التخدير القائم على sodium pentobarbital، وكيفية اختبار مدى كفاية التخدير، وحماية القرنية، وتجهيز الموقع الجراحي، والتطهير، وورقة بيانات جراحة بقاء الفئران، والجناح الجراحي، وإجراء شق في الخط الناصف البطني عبر الجلد وجدار البطن، وإخراج قرني الرحم للخارج.

الجزء الثاني هو الحقن المجهري عبر الرحم. حيث نستعرض الإضاءة النافذة للجنين، وإعادة توجيه الجنين، والحقن المجهري، وتصنيع الماصة، والحقن المجهري في الأذن في اليوم الجنيني 11.5 واليوم الجنيني 12.5. أما الجزء الثالث فهو التثقيب الكهربائي في الجسم الحي.

نوضح في هذا المقطع طريقة وضع أقطاب كهربائية من نوع المجداف، وعملية التثقيب الكهربائي في أذن فأر جنيني في اليوم 11.5. يمثل الجزء الرابع النتائج النموذجية؛ حيث نعرض تعبير GFP في القواقع في المراحل الجنينية المتأخرة والمراحل المبكرة بعد الولادة.

نتج ذلك عن التثقيب الكهربائي في الجسم الحي لأذن الجنين باستخدام بلازميد التعبير في اليوم الجنيني 11.5، الجزء الأول: فتح البطن الظهري. يتم تثبيت الأم بإحكام عن طريق الإمساك بالجلد خلف الرقبة، والذيل، والطرف الخلفي الأيسر. يتم إعطاء حقنة داخل الصفاق من مخدر يعتمد على sodium pentobarbital بعد مسح البطن بـ 70%ethanol.

يُوضع الفأر داخل قفصه المنزلي لمدة تتراوح بين أربع إلى خمس دقائق للسماح للمخدر بالعمل. وتُستخدم قرصات القدم والذيل لتقييم مدى كفاية التخدير. تظهر هذه الأم ارتعاشاً استجابةً لقرصة الذيل، وتحتاج إلى دقيقتين إضافيتين قبل أن تصبح غير مستجيبة للمنبهات الضارة.

يتم وضع مرهم عيني معقم على العينين لحماية القرنيات من الجفاف. نقوم بتجهيز موقع الجراحة داخل خزانة استنشاق كيميائية لتقليل انتشار الفراء والقشرة. يتم حلاقة الفراء باستخدام شفرة دقيقة لكشف الجلد الذي يغطي جدار البطن.

تسهل إزالة الفراء بالكامل التئام الشق الجراحي بعد العملية. ويتم تعقيم جلد البطن عن طريق تمرير 70% ethanol وBetadine، ثم 70% ethanol بالتناوب. يجب المسح دائماً من الجهة المنقارية إلى الجهة الذيلية، مع استخدام كرة قطن جراحية جديدة أو مسحة قطنية في كل مرة.

في كل مرحلة مسح، نقوم بتقييم عمق وجودة التنفس أثناء عملية التطهير للتأكد من أن الأنثى غير مستجيبة. وبعد عملية المسح الثانية بـ 70% ethanol، نضع الأنثى فوراً بحيث يكون السطح البطني للأسفل على قطعة قماش معقمة، ثم نضعها على وسادة حرارية لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق لتدفئتها. ويعد هذا الوقت مناسباً لتسجيل البيانات السابقة للجراحة في ورقة سجل جراحة بقاء الفئران. لقد أرفقنا ورقة بيانات جراحة بقاء الفئران كمعلومات تكميلية.

يُنصح بتضمين ورقة البيانات وبروتوكول رعاية الحيوان الخاص بك حتى تتمكن لجنة رعاية واستخدام الحيوان في مؤسستك من الاطلاع على كيفية مراقبة البيانات قبل الجراحة وأثناءها وبعدها. نقوم بتعبئة ورقة سجل واحدة لكل موضوع جراحي. ونفضل إجراء الجراحة في بيئة معقمة، على الرغم من أن هذا لا يكون مطلوباً عادةً للقوارض.

يكون سطح العمل منفصلاً عن محرك المنفاخ وهيكل الغرفة الضغطية، لذا لا تنتقل أي اهتزازات إلى المستخدم. وأثناء عملية الحقن المجهري، أرفقنا كمعلومات تكميلية مخططاً للتعديلات التي أجريناها على غطاء التدفق الصفائحي لتسهيل عملية نقل الجينات إلى الجنين في الرحم (In utero)، وتتمثل التغييرات الأساسية في تحديات الواط المنخفض وفتحات إضاءة المسار ومقابس مخفية لكابلات طاقة الأجهزة، ومسار توجيه للدوائر الكهربائية الملحقة. وتتكون جناح الجراحة من كيس محلول رينجر اللاكتات الوريدي الكهربائي، وحمام مائي دافئ، ومناور XY وZ، ومجهر تشريحي فلوري ستيريو، ومصدر ضوء من الألياف البصرية، وأدوات جراحية.

تُستخدم الدواسات لتحفيز المحقن الدقيق، وجهاز التثقيب الكهربائي، والتركيز. يتم تعقيم الأدوات الجراحية للمجهر في جهاز التعقيم (autoclave). ويجب إعادة تعقيم الأدوات بين كل فأر وآخر باستخدام معقم الخرز الزجاجي أو عن طريق إعادة تعقيم ماسك الإبر في جهاز التعقيم.

تعد مقصات Balli وملاقط الحلقة والملاقط الوعائية أدوات أساسية. يتم إجراء شق في الخط الناصف البطني، ثم تُمسك البشرة باستخدام الملاقط الوعائية ويُستأصل الغلاف الجلدي باستخدام المقصات ذات الرأس الكروي، مع تمديد الشق من 10 إلى 14 Millimeters. يتم تحديد الشريط الأبيض غير الوعائي من النسيج الضام الذي يُسمى الخط الأبيض (linea alba) والخط الناصف البطني للبطن، ثم يُشق الخط الأبيض باستخدام المقصات ذات الرأس الكروي.

مع توخي الحذر لتجنب جرح الأمعاء أو الوسائد الدهنية الإربية. قم فوراً بري تجويف البطن بمحلول رينجر لاكتات المعقم والمدفأ مسبقاً. ثم قم بتقييم مواقع الشقوق في الجلد وجدار البطن للتأكد من عدم وجود نزيف.

سيؤدي الضغط المباشر باستخدام ملقط غير حاد إلى إيقاف النزيف البسيط في حال وجوده، ثم يتم إخراج قرني الرحم الأيمن والأيسر باستخدام ملقط ذي أطراف حلقية. يتم التقاط قرن الرحم الأيمن برفق بإحدى النهايات الحلقية للملقط وسحب الرحم باتجاه الشق الموجود في الخط الناصف. استخدم يدك الحرة لتحريك الجانب الجانبي للأم برفق لتسهيل عملية سحب الرحم.

لا تُستخدم الملاقط مطلقاً لضغط الرحم وسحبه للخارج؛ حيث يمكن أن يؤدي ذلك إلى إتلاف الأوعية الدموية الرحمية أو الأجنة. كرر إجراء الإخراج الخارجي للقرن الرحمي الأيسر. قم فوراً بري القرون الرحمية المُخرجة حديثاً بمحلول رينجر اللاكتات الدافئ مسبقاً، ثم أعد إدخال الوسائد الدهنية الداخلية أو الأمعاء برفق في حال خروجها مع الرحم.

لا يتكرر حدوث هذا الأمر كثيراً. الجزء الثاني: الحقن المجهري في الرحم. يتم وضع الأم أسفل الشيئية ذات مسافة العمل الطويلة، ويُثبّت ضوء ليف بصري مرن مقابل جدار الرحم.

يتم الضغط برفق على الرحم باستخدام إصبع اليد الحرة، وذلك لتسهيل تحديد اتجاه الجنين. يجب أن يكون الضوء المنبعث من كابل الألياف الضوئية عند أدنى شدة مطلوبة لتقييم اتجاه الجنين بدقة.

يمكن للضوء المكثف أن ينقل الحرارة إلى الرحم، مما قد يؤدي إلى حدوث مضاعفات. لذا، نقوم بإمساك سلك الضوء الليفي والرحم بيد واحدة، ونستخدم إصبعاً من اليد الأخرى لإعادة توجيه الجنين عن طريق الجس اللطيف. نوضح ذلك في مقاطع الفيديو الثلاثة التالية عبر مجهر EC وتوجيهات الأجنة الشائعة التي لوحظت في الرحم.

سيرى المشاهد الرؤية المجهرية التي نراها أثناء الإضاءة النافذة، وبالرغم من أنها تظهر باللونين الأبيض والأسود، إلا أن الإضاءة النافذة للرحم تسمح بالكشف عن اتجاه الجنين في الجسم الحي. في هذا المثال، يتخذ الجنين وضعية الوقوف على الرأس مع مواجهة سطحه البطني للمشاهد. ومن خلال تحريك الرحم ذهاباً وإياباً، يمكننا تحديد الأطراف الخلفية اليمنى واليسرى، والذيل، والرأس من جهة العين اليسرى.

في هذا المثال، يكون الجنين مرة أخرى في وضعية الوقوف على الرأس، ولكن مُداراً بنحو 90 درجة بالنسبة للمحور الأمامي الخلفي. ومن خلال تحريك الرحم بلطف ذهاباً وإياباً، يمكننا رؤية الأشكال المجدافية التي تحدد الطرف الخلفي الأيسر والطرف الأمامي الأيسر. كما يظهر الدماغ الخلفي بوضوح أيضاً.

يكون الجنين في وضع عمودي بحيث يواجه جانبه الأيسر الناظر. ويمكن اكتشاف البطين الرابع الناشئ كبقعة ساطعة في الدماغ الخلفي. كما تظهر بوضوح الرأس العينية اليسرى، والطرف الأمامي الأيسر، والأطراف الخلفية اليسرى.

يؤدي الضغط الخفيف على الرحم إلى إعادة توجيه الأجنة قليلاً لتمكين الكشف عن الجذع الرئيسي للوريد الرأسي الأولي وفرعيه الأمامي والخلفي، واللذين تم تمييزهما بنجمة بيضاء وسوداء على التوالي. وكما سنرى، يقع الـ Otis في منتصف المسافة بين الفرعين الأمامي والخلفي للوريد الرأسي الأولي. ولا يمكن رؤية الـ Otis نفسه من خلال الرحم بواسطة الإضاءة النافذة.

نوضح في مقطعين متتاليين من المجهر الفيديو كيفية إعادة توجيه الجنين للحقن المجهري باستخدام أداة مساعدة Otis. الهدف هو تحديد المعالم الجنينية التي تسمح باستنباط موقع الـ otis في الرأس الجانبي. وبناءً على ذلك، فإن هدفنا هو إعادة توجيه الجنين من الوضع الظهري إلى الوضع الجانبي حتى نتمكن من تحديد الوريد الرئيسي للرأس.

يظهر الدماغ المتوسط والبطين الرابع والطرف الأيسر في الموضع الظهري. ويؤدي الضغط الخفيف على الرحم إلى تغيير توجيه الجنين من الموضع الظهري إلى الموضع الجانبي. وبذلك تصبح العين اليسرى والرأس والدماغ المتوسط والبطين الرابع واضحة تماماً.

يظهر بوضوح أيضاً الوريد الرأسي الأساسي وفرعه الخلفي المشار إليه بالنجمة. أما الفرع الأمامي للوريد الرأسي الأساسي فلا يمكن رصده بوضوح. هدفنا مرة أخرى هو توجيه الجنين بحيث يمكن تحديد الوريد الرأسي الأساسي، ولكن تحت تكبير أعلى يتناسب مع عملية الحقن المجهري في الرحم.

تظهر الأوعية الرحمية والنطاق الساقط والعين اليسرى في هذا المنظور الجانبي. يؤدي الضغط اللطيف على الرحم إلى إزاحة موضع الجنين، مما يسمح لنا برصد البطين الرابع والعين اليسرى. يمثل الوريد الرأسي الأساسي وفرعه الخلفي المشار إليه بالنجمة، والوريد الرأسي الأساسي وفروعه شكل قوائم كرة القدم الأمريكية.

لا يمكن رؤية الحويصلة الأذنية من خلال الرحم، ولكنها تقع في مركز الدعامات. وقد بدأت لين تسلسلاً للحقن لجنين واحد؛ حيث تقوم بإضاءة الرحم عبرياً، وإعادة توجيه الجنين لإجراء الحقن المجهري، ثم إدخال ماصة الحقن المجهري المملوءة بصبغة fast green إلى مجال الرؤية.

تُثبت ماصة الحقن المجهري في حامل ماصات يتم التحكم به بواسطة مناور مجهري ثلاثي المحاور (X، Y، z). يتصل الحامل المغناطيسي للمناور بصفيحة فولاذية ذات قاعدة من التفلون تسمح بتحديد الموضع العام لماصة الحقن المجهري بكل سهولة. يتم دفع الإبرة للأمام باستخدام مقبض تحكم الميكرومتر الأمامي الموجود في المناور بشكل مناسب.

تعد الماصات المُصنعة أساسية لإجراء الحقن المجهري الصدمي في جنين الفأر في مرحلة Otis المبكرة. نقوم بسحب أنابيب شعرية من زجاج البوروسيليكات سميكة الجدران باستخدام ساحب ماصات أفقي. يتم كسر الماصة الناتجة الموضحة في A يدويًا باستخدام ملقط عند موضع القطر الخارجي الذي يتراوح بين 14 إلى 16 ميكرون والمشار إليه برأس السهم في B. ويكون الكسر الخشن للماصة الموضح في C مسننًا وهشًا.

نقوم بشطف الماصة بزاوية 20 درجة تقريبًا لشحذ طرفها كما هو موضح في اللوحة D، وتتوفر معايير سحب وشطف مصاصات الحقن المجهري في النص المصاحب. ونعرض في مقطعي الفيديو التاليين المجهريين عملية الحقن المجهري في الحويصلة الأذنية للجنين الفأري في الأيام الجنينية 11.5 و12.5. هدفنا هو توضيح الحقن المجهري في الحويصلات الأذنية للفئران في اليوم الجنيني 11.5.

أولاً، نقوم بحقن الأوتيكات (otics) في غياب الرحم لإظهار كيفية ظهور الحقن الموجه بشكل صحيح وبدون لبس. بعد ذلك، نقوم بتوضيح عملية الحقن الدقيق عبر الرحم بشكل فعلي. وبالنسبة لعملية الحقن الأولى هذه، تم شق الرحم بالكامل للسماح ببروز الكيس الحشوي، ثم تمت إزالة الشريط الساقط الذي يغطي كيس المح yolk sac الحشوي.

تظل المشيمة متصلة بالرحم ويكون الجنين على قيد الحياة. ومع الإزالة البؤرية للرحم، نرى البطين الرابع، والوريد الرأسي الأساسي وفرعيه الأمامي والخلفي، والماصة والموقع التقريبي للكيس باللون الأبيض. وفي بداية تسلسل الحقن هذا، يتم الكشف عن تدفق الدم في الأوعية الدموية للكيس المحي الحشوي.

يتم دفع الماصة عبر كيس المح yolk sac الحشوي ويتم حقن dai في osis note، والقناة اللمفاوية الداخلية ظهرياً وموضع otics في مركز uprights. تقع otics في منتصف المسافة بين الفرعين الأمامي والخلفي للوريد الرأسي الرئيسي، ويتطلب الحقن المجهري الرحمي في otics الجنينية للفأر في اليوم embryonic day 11.5 تحديد الوريد الرأسي الرئيسي وأحد فروعه على الأقل لتقدير موقع otic assist.

في هذا المثال التوضيحي، تم رصد كل من الفرعين الأمامي والخلفي للوريد الرئيسي في الرأس، مع تحديد منطقة OUC باللون الأبيض. أما العرض الأكثر واقعية للجنين فهو الذي يتم فيه رصد الجذع الرئيسي للوريد الرئيسي في الرأس مع أحد فرعيه فقط، وفي المثال المعروض يظهر الفرع الخلفي للوريد الرئيسي في الرأس فحسب، وهذا يكفي لتفسير موقع الأذينين. يتم تمرير PT عبر الرحم ثم تُحقن الصبغة في الأذينين.

ننتظر لمدة 30 ثانية للسماح للصبغة بالتلاشي من التجويف السلوي، وعند هذه النقطة يمكننا رؤية القناة اللمفاوية الداخلية ظهرياً والدهليز. ونختتم بعرض بتكبير منخفض للجنين الذي قمنا للتو بحقن كيسه لتوفير منظور تشريحي في هذا العرض، حيث يظهر البطين الرابع والعين اليسرى والأوعية الدموية الرحمية. نحن نستعرض هنا عملية الحقن عبر والحقن المجهري في الكيس الأذني لجنين الفأر في اليوم الجنيني 12، والحقن المجهري في البطين الرابع الناشئ في الدماغ الخلفي.

يتيح لنا النفاذ الضوئي اكتشاف الوريد الرأسي الأساسي في هذا المنظر الجانبي الأيسر بالإضافة إلى العين. يتم دفع الماصة عبر الرحم وصولاً إلى الحويصلة الأذنية، ثم تُحقن الصبغة لملء تجويفها. ولحقن البطين الرابع، نقوم بتدوير الجنين بمقدار 90 درجة للحصول على منظر ظهري للدماغ الخلفي.

أصبحت الكيسة اليسرى المحقونة الآن على الجانب الأيسر. يتم دفع الماصة عبر الرحم، ثم يُحقن صبغة الأخضر السريع (fast green) الممزوجة مع dextran المقترن بـ lor في البطين الرابع.

لاحظ أن حجم الصبغة المحقونة لا يدخل إلى الدماغ المتوسط في الجسم الحي. يتم تقييم الفلورة بعد الحقن للتحقق من تموضع الديكستران في البطين الرابع. بعد ذلك، يتم تغيير اتجاه الجنين من الوضع الظهري إلى الوضع الجانبي.

توجد القناة اللمفاوية الداخلية في موقع بطني بالنسبة للبطين الرابع في هذا العرض الجانبي. ويؤكد التألق الفلوري في الجسم الحي تموضع الدكستران في البطين الرابع. عند الولادة، نقوم بفحص الجراء للكشف عن التألق الأخضر في البطين الرابع باستخدام مجهر فلوري انعكاسي.

تمتلك جراء مجهر التشريح ذات الفلورية الخضراء في أدمغتها الخلفية أذنًا داخلية تم التلاعب بها أثناء التخلق الجنيني الجزء الثالث: التثقيب الكهربائي داخل الجسم. بعد ملء الكيس ببلازميد التعبير، يتم ري الرحم حديثًا بمحلول رينجر اللاكتاتي المسخن مسبقًا. يسهل الإضاءة النافذة عملية تمركز كيس ODU في مجال القطب الكهربائي.

يتم سحب الرأس المعدني للياف الضوئية من سطح الرحم. وقبل البدء في سلسلة نبضات الموجة المربعة، نعرض في مقطع الفيديو المجهري التالي دورة تثقيب كهربائي كاملة في الجسم الحي. يتطلب التثقيب الكهربائي للكيس الأذني للجنين في الفأر في اليوم الجنيني 11.5 وضع أقطاب كهربائية على شكل مجداف برفق على الرحم.

في هذا المثال، تم ملء الكيس الأذني الأيسر ببلازميد التعبير، ورُوي الرحم حديثاً بمحلول رينجر اللاكتات. تم وضع الكاثود جانبياً بالنسبة للكيس الأذني المملوء، بينما وُضع الأنود إنسياً؛ في بداية تسلسل العملية، يكون الكيس الأذني متمركزاً في مجال المجداف. يتم ضغط الرحم برفق، ثم يبدأ تدفق نبضات الموجة المربعة باستخدام مفتاح دواسة القدم.

من الناحية المثالية، يتم توصيل تيار تتراوح شدته من 60 إلى 100 مللي أمبير لكل نبضة. بعد ذلك، يتم تحرير الرحم وغسله على الفور. ثم يُعاد الرحم المغسول حديثًا إلى التجويف البطني عن طريق الضغط اللطيف باستخدام ملقط الحلقة.

بمجرد إرجاع الرحم إلى الداخل، يتم غسل التجويف البطني بنحو 4 ml من محلول رينجر اللاكتاتي، مع ترك حوالي 1 ml من محلول رينجر اللاكتاتي في التجويف البطني للمساعدة في الحفاظ على ترطيب الأم التي ستشرب كمية مياه أقل من المعتاد فور إجراء الجراحة البطنية. يتم إغلاق جدار البطن ثم الجلد باستخدام خيوط جراحية قابلة للامتصاص بواسطة حامل الإبر. يتميز حامل الإبر الذي نستخدمه بوجود مقص مدمج يسهل عملية الإغلاق.

نفضل استخدام الغرزة الجارية لكل من جدار البطن والجلد. ونقوم بتثبيت كل غرزة ثانية لتوفير دعم إضافي في موقع الشق. كما نقوم بإعطاء دواء مضاد للالتهاب غير ستيرويدي تحت الجلد قبل وضع الأم في قفص التعافي.

استشر طاقم الطب البيطري لديك بشأن المسكنات الوقائية التي تفضلها لجنة رعاية واستخدام الحيوان في مؤسستك. يتم وضع الأم داخل غطاء معقم على أرضية قفص الإفاقة المدفأ. يحتوي قفص الإفاقة على مواد للتعشيش، وأنبوب أحمر للتغطية، وعلف مختبري، وزجاجة ماء.

يُعاد تجميع القفص مع وضع غطاء المرشح في الأعلى في صباح اليوم التالي للجراحة. تكون الأم في حالة تهيئة جيدة، وقادرة على الحركة، وتستطيع التوازن على أطرافها الخلفية لاستكشاف الجزء العلوي المفتوح من القفص. كما يبدو خط الخياطة في البطن نظيفاً وجافاً، ولا تظهر عليه أي علامات للانفصال أو الاحمرار أو التورم.

لقد أرفقنا وثيقة تناقش تطوير بروتوكول رعاية الحيوانات لنقل الجينات في الرحم. تحتوي الوثيقة على صياغة قد تكون مفيدة أثناء تصميم بروتوكول خاص بالمؤسسة بالتشاور مع لجنة رعاية واستخدام الحيوانات لديكم. الجزء الرابع، النتائج التمثيلية.

تظهر لوحات النتائج التمثيلية A و B قوقعة تمثيلية من جرو في اليوم السادس بعد الولادة، حيث تم حقن منطقة الـ Otis لديه ببلازميد تعبير البروتين الفلوري الأخضر المعزز في اليوم الجنيني 11.5 ثم تم إجراء التحليل الكهربائي. تمت إزالة الجدار الجانبي للقوقعة من المنطقة الوسطى والقمة. يظهر تعبير GFP فقط من قاعدة القوقعة إلى المنطقة الوسطى، ويتبع توزيع علامة الخلايا الشعرية myosin seven A الموضحة في اللوحة B. وتظهر اللوحة C عرضاً إسقاطياً مجهرياً بؤرياً بتكبير منخفض لليوم الجنيني.

عضو كورد في فأر يبلغ من العمر 18.5 يوماً مصبوغ مناعياً باستخدام جسم مضاد myosin seven A، حيث تتوزع الخلايا المنقولة في جميع أنحاء عضو كورد. يوضح اللوح D إسقاطاً بؤرياً عالي التكبير لعضو كورد في فأر في اليوم الجنيني 18.5 مصبوغاً بـ cin.Seven.

يتم اكتشاف تعبير GFP في الخلايا الشعرية الداخلية والخارجية، والخلايا بين المفاصل، وخلايا الركيزة، وخلايا TER. يؤدي نقل الجينات بوساطة التثقيب الكهربائي إلى الأذن في اليوم الجنيني 11.5 إلى ترانسفكشن الخلايا السلفية التي تعطي أصل جميع أنواع الخلايا المكونة داخل عضو كورتي.