تحليل فسيفساء من وظائف الجينات في الدماغ بعد الولادة ماوس التنمية عن طريق استخدام فيروس لجنة المساواة العرقية القائمة على التوحد

الهدف العام من هذا الإجراء هو التحكم في وظيفة الجين خلال فترة تطور الدماغ بعد الولادة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق اختيار وتجهيز الفيروسات المناسبة، ثم تحميلها في المحقنة وتجهيز معدات الحقن. بعد ذلك، يتم حقن الفيروس في أدمغة صغار الفئران حديثة الولادة، وتتمثل الخطوة النهائية في التضحية بالحيوانات وتصوير المناطق التي تم حقنها.

وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر تباين الوسم بين الخلايا الضابطة والخلايا التي تم تعطيل جيناتها (knockout) من خلال مجهر التألق المناعي. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال علوم الأعصاب، مثل كيفية التنظيم الجيني لفترة النمو بعد الولادة. ولغرض الحقن، يمكن استخدام محلول فيروس مرتبط بـ adeno متاح تجارياً بعيار كامل، عادة ما يكون 10¹² نسخة جينومية لكل milliliter للتلاعب بعدد كبير من الخلايا.

إذا كان المطلوب الحصول على توزيع متباعد أو وسم، ابدأ بتخفيف بنسبة 1 إلى 10. بعد إذابة الفيروس على الثلج، انقل حجم التخفيف المسبق فوراً إلى أنبوب PCR معقم سعة 250 microliter. حافظ على التخفيف على الثلج.

قم بتجهيز مضخة الحقن عن طريق اختيار سرنجة مناسبة وتوصيلها بإبرة تحميل. بعد ذلك، اسحب محلول الفيروس برفق حتى تظهر فقاعة هواء صغيرة جداً في السرنجة، ويمكن استخدام صبغة تحميل خاملة لتسهيل هذه الخطوة. الآن، قم بتثبيت السرنجة في المضخة باستخدام مثبت.

بعد ذلك، قم بتوصيل أنبوب التوصيل برفق بين المحقنة وحامل الإبرة. تأكد من أن إبرة الحقن في تلامس مباشر مع أنبوب التوصيل داخل حامل الإبرة. الآن، حرك المحلول ببطء عبر أنبوب التوصيل حتى تظهر قطرة صغيرة من المحلول عند طرف الإبرة.

قم بتثبيت المكبس بعناية بجوار كتلة الدفع باستخدام دعامة على المضخة. اضبط معدل الحقن على 8 µL في الدقيقة، واضبط حجم الحقن ليكون بين 1 و 2 µL. بعد ذلك، قم بتعديل إعداد قطر محقنة المضخة ليتناسب مع قطر المحقنة التي تستخدمها.

وأخيراً، لحماية الجراء خلال مرحلة التعافي، اضبط السخان الكهربائي على 38 درجة Celsius وقم بتغطيته بمنشفة ورقية. وباستخدام بروتوكول معتمد من لجنة الرعاية والمؤسسية لاستخدام الحيوانات (IACUC)، قم بتجهيز جراء الفئران في اليوم صفر (P zero) أو اليوم الأول (P one) للحقن عن طريق إخضاعها للتخدير بالتبريد. بلل بضع مناشف ورقية بالماء وضعها على الثلج.

بعد ذلك، ضع أربعة أو خمسة من الجراء على المناشف الورقية مع الفصل بينهم جيداً. اطوِ المناشف الورقية فوق الجراء، ثم ضع برفق كمية صغيرة من الثلج المجروش فوق المناشف الورقية واترك الجراء في هذه الحالة لمدة خمس دقائق تقريباً. يمكن الاحتفاظ بالجراء بأمان على الثلج لمدة تصل إلى 15 دقيقة مع إمكانية تعافيها بشكل جيد.

الآن، ضع الجرو المخدر على كتلة تثبيت لضمان أفضل وصول إلى موقع الحقن. فعلى سبيل المثال، يمكن الوصول إلى القشرة المخية بسهولة أكبر عن طريق وضع الحيوان بشكل مسطح على بطنه. يمكن تثبيت الجرو في مكانه باستخدام ضمادة لاصقة، مع تثبيت رأس الجرو يدويًا وشد الجلد بإحكام لمنعه من الحركة.

ثم حدد المعالم التشريحية للجمجمة مثل الدرز السهمي (lambda suture)، واختر نقطة حقن يمكن تكرارها، وباستخدام اليد الأخرى، أدخل الإبرة برفق عبر الجمجمة. لا تضغط بقوة إذا لم تخترق الإبرة الجمجمة بسهولة؛ بل قم بإعادة توجيه الإبرة وحاول مرة أخرى برفق.

يختلف عمق الحقن بشكل طفيف بين الحيوانات والسلالات المختلفة بالنسبة للقشرة المخية، وعادةً ما يكون العمق من نصف مليمتر إلى مليمتر واحد مناسباً. الآن، قم بحقن محلول الفيروس من خلال طلب تفعيل المضخة من قبل زميل لتقليل حركات اليد. ومن المثالي استخدام دواسة قدم لتشغيل المضخة بعد عملية الحقن.

اترك الإبرة في مكانها لبضع ثوانٍ، ثم مع الحفاظ على ثبات رأس الجرو، اسحب الإبرة للخارج بسلاسة. الآن، اترك الجرو ليتعافى لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق على اللوح الساخن المغطى.

خلال هذا الوقت، استمر في حقن الجراء الأخرى. وعندما تستعيد جميع الجراء لونها الوردي وتبدأ جميعها في الحركة، قم بفركها بلطف بجزء من فراشها الأصلي. عندها فقط يمكن إعادتها إلى أمها.

وخلاف ذلك، قد يتم التعامل معهم كجراء غير مألوفة، وهو ما قد يدفع الأم في أغلب الأحيان إلى قتلهم بعد إعادتهم إليها. قم بتنظيف مجموعة أدوات الحقن عن طريق ملء المحقنة بالكامل بالأسيتون أو بـ 70% ethanol. وفي حال استخدام مكونات حساسة للأسيتون مثل السيلكون أو المواد اللاصقة، قم بشطف المحلول عبر مجموعة أدوات الحقن عدة مرات باستخدام محلول جديد في كل مرة.

سيؤدي ذلك إلى إزالة أي محلول فيروسي متبقٍ ورواسب المذيبات التي ستتبخر. بعد شطف الجهاز، قم بتطهير منطقة العمل باستخدام المبيض لتركها جاهزة للمجرب التالي. تؤدي التقنية الناجحة إلى إحداث عدوى عصبونية قوية في موقع الحقن.

عادةً ما تؤدي الحقن في مناطق محددة مثل القشرة المخية والرتيب العلوي إلى حدوث عدوى موضعية مع حد أدنى من الانتشار إلى المناطق المجاورة. إن استخدام محلول فيروسي ذي عيار مرتفع يجعل من إصابة المناطق المجاورة، مثل الحصين، أمراً أكثر احتمالاً مقارنة بالحقن بمحلول فيروسي ذي عيار منخفض. وتؤدي هذه الأخيرة إلى عدوى متفرقة تكون عادةً بالقرب من موقع الحقن، كما هو الحال في الحقن المخيخي عند الخط الناصف؛ ومن المفترض أن يرتبط عدد الخلايا المصابة بعيار المحلول الفيروسي المحقون.

على سبيل المثال، يؤدي حقن مزيج من محاليل ذات عيار مرتفع من فيروسين R AAV eight يعبران عن بروتينات فلورية مختلفة في المخيخ إلى إصابة العديد من خلايا Purkinje التي يتم وسمها بشكل متباين. وعلى العكس من ذلك، يمكن أن يؤدي حقن محلول فيروسي ذو عيار منخفض إلى إصابة متفرقة للمساعدة في تصور الخلايا المفردة. ويمكن ملاحظة العصبونات الموصومة فلورياً بشكل مباشر في الأنسجة الحية المقطوعة حديثاً، أو يمكن إخضاعها للتلوين المناعي.

يعزز هذا من إشارات الفلورة الداخلية من أجل عملية التقاط الصور لاحقاً باستخدام المجهر الفلوري ذو المجال الواسع أو المجهر الفلوري البؤري. وأخيراً، يتميز RAAV eight بقدرته على إصابة أنواع مختلفة من العصبونات في القشرة المخية مع وسم قوي للزوائد الدقيقة. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون 30 دقيقة تقريباً إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.