الجسيمات أسلوب التلصيق لتحديد فيروس شلل الأطفال

الهدف العام من الإجراء التالي هو التعرف السريع على عزلات فيروس شلل الأطفال باستخدام بروتوكول بسيط. نستخدم في هذا المقايسة جسيمات جيلاتينية مُحسَّسة ومغلفة بجزيئات خيمرية تحتوي على النطاق خارج الخلوي لمستقبل فيروس شلل الأطفال البشري المرتبط بـ IgG two fc. ونظرًا لأن هذه الجسيمات تمتلك ألفة موحدة لجميع الأنماط المصلية لعزلات فيروس شلل الأطفال، فإن تلاؤم الجسيمات يحدث عند التحضين مع العينات التي تحتوي على أي فيروس شلل أطفال بشري.

ومع ذلك، إذا كانت هناك أجسام مضادة قادرة على التعرف على الفيروس النوعي المعزول من العينة، يحدث التحييد ويمنع التلازن؛ باستخدام هذا النظام التجريبي، يمكن إجراء تحديد سريع لعزلات فيروس شلل الأطفال في تفاعل خطوة واحدة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالفحوصات المتاحة، مثل اختبار التحييد التقليدي، تكمن في بساطة الإجراء والتفسير، بهدف تقليل الجهد المطلوب وتسريع الحصول على النتائج. لإعادة تشكيل الأجسام المضادة anti PV one و PV two و PV three، أضف 0.5 milliliters من الماء إلى كل قارورة.

ثم انقُل كل محلول أجسام مضادة إلى أنابيب منفصلة تحتوي على 4.5 milliliters من وسط الصيانة. تتوفر بعض تشغيلات الأجسام المضادة لـ PV في شكل مُعاد تكوينه، وبالنسبة لهذه التشغيلات من الأجسام المضادة لـ PV، فإن إضافة الماء لإعادة التكوين ليست ضرورية.

بعد ذلك، قم بتحضير خلطات بنسبة واحد إلى واحد من محلول الأجسام المضادة المدمجة بحجم نهائي قدره 3.6 milliliters في أنابيب جديدة ومصنفة. على سبيل المثال، اخلط 1.8 milliliters من anti PV one مع 1.8 milliliters من anti PV two. ولتحضير تركيبة anti PV one plus PV two، كرر هذه العملية لكل مجموعة زوجية ممكنة، وقم أيضاً بتحضير محلول يحتوي على جميع الأنواع الثلاثة من الأجسام المضادة عن طريق خلط 1.2 milliliters من كل مصل مضاد معاً.

بمجرد تحضير الخلطات الأربعة بإضافة 720 µL من FCS إلى كل محلول أجسام مضادة. سيساعد ذلك في تقليل التلازن غير النوعي لجزيئات الجيلاتين بواسطة الأجسام المضادة أثناء المقايسة. يمكن تخزين تجمعات الأجسام المضادة عند درجة حرارة -20 °C حتى يتم استخدامها في مقايسة التلازن.

في هذا المقايسة، نستخدم جزيئات الجيلاتين المجففة بالتجميد والمغلفة بالنطاقات خارج الخلوية لمستقبل فيروس شلل الأطفال البشري ونطاقات FC لـ IgG2 خاصة بالفأر. تأكد من استخدام دفعة واحدة من الجزيئات وعدم استخدام دفعات مختلفة في تجربة واحدة لضمان اتساق صورة التلازن؛ لإعادة تشكيل الجزيئات، أضف 1.5 milliliters من محلول إعادة التشكل المنظم إلى كل قارورة. انقر بلطف للمزج جيداً.

يمكن تخزين الجسيمات المعاد تشكيلها في درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. أولاً، قم بتصميم تجربتك في طبق معايرة دقيقة مكون من 96 بئراً. وبالنسبة لكل عينة، سيحتوي البئر رقم واحد على الفيروس وحده.

ستحتوي الآبار من رقم اثنين إلى خمسة على الفيروس بالإضافة إلى واحد من محلول الأجسام المضادة المختلطة الأربعة. تأكد من تخصيص بئر واحد كضابط سلبي يحتوي على الوسط الغذائي فقط دون فيروس أو أجسام مضادة. بمجرد تجهيز الطبق، أضف 12 µL من محلول الأجسام المضادة الصحيح إلى كل بئر من الصفوف من اثنين إلى خمسة و 12 µL من وسط النمو.

أضف الوسط إلى الفيروس وحده في آبار الصف الأول، وإلى بئر التحكم السلبي في الصف السادس. بعد ذلك، أضف 12 µL من عينة الفيروس في الصفوف الخمسة الأولى، و12 µL من وسط النمو إلى بئر التحكم السلبي في الصف السادس. وبمجرد توزيع الأجسام المضادة والفيروس في الأطباق، قم بإعادة تعليق جزيئات الجيلاتين المعاد تكوينها عن طريق النقر عليها برفق، ثم أضف على الفور 25 µL من الجزيئات لكل بئر في جميع الآبار.

من المهم عدم السماح للجزيئات بالترسب قبل نقلها إلى الطبق لضمان الحصول على كميات متساوية من الجزيئات في كل عين. ضع طبق المقايسة على جهاز خلط الأطباق واخلطه لمدة 30 ثانية. ثم ضع الطبق على ورقة بيضاء واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين للسماح بحدوث التلازن.

من المهم عدم تحريك الطبق في أي وقت أثناء أو بعد فترة الحضانة لأن التلازن المتكون يكون غير مستقر. بمجرد حدوث التفاعل، التقط عدة صور للطبق بحيث يمكن تقدير جودة التلازن في كل بئر. في الآبار التي لم يحدث فيها تلازن، كما هو موضح هنا على اليسار، ستترسب جزيئات الجيلاتين الملونة في قاع البئر، بينما في الآبار التي حدث فيها تلازن.

بسبب التفاعل بين الفيروس و pvr، وجسيمات الجيلاتين المغلفة بـ IgG two A، يظهر نمط ملون منتشر كما هو موضح في المركز. في هذه التجربة، اختبرنا قدرة المحاليل الفيروسية، PV one و two و three، على تحفيز التلازن في وجود الجسم المضاد. وبالنسبة للمجموعات الموضحة هنا في غياب الفيروس أو الأجسام المضادة، لا يحدث تلازن وترسب جسيمات الجيلاتين، وذلك على عكس الآبار التي تحتوي على الفيروس ولكن بدون أجسام مضادة.

حدث التلازن نتيجة تفاعل الفيروس. ومع جزيئات الجيلاتين المغطاة بـ PVR IgG في الآبار التجريبية، يتم منع تلازن الفيروسات في أي بئر يحتوي على أجسام مضادة تعادل ذلك الفيروس بشكل محدد. فعلى سبيل المثال، يتم منع تلازن فيروس شلل الأطفال من النوع الأول في الآبار التي تحتوي على أجسام مضادة لـ PV 1، ولكن ليس في الآبار التي تحتوي فقط على أجسام مضادة لـ PV 2 و PV 3.

وينطبق الأمر ذاته على النوعين الثاني والثالث من فيروس شلل الأطفال. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إجراؤها في غضون ثلاث ساعات فقط إذا نُفذت بشكل صحيح.