العزلة، تحديد الهوية، وتنقية خلايا الفئران التوتة طلائي

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا الظهارية أو التقنية الصعترية وتحديدها وتنقيتها. يتم تحقيق ذلك عن طريق الهضم الأنزيمي أولا وتعطيل الغدة الصعترية لفصل التكنولوجيا في معلق خلية واحدة. بعد ذلك ، يمكن تحليل التكنولوجيا عن طريق قياس التدفق الخلوي أو إثرائها عبر استراتيجية التحريك.

في النهاية ، يمكن تنقية المجموعات الفرعية الظهارية الصعترية عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على العديد من الأسئلة الرئيسية في مجال تطور الخلايا التائية ، مثل ، كيف تعزز الخلايا الظهارية الصعترية الانتقاء الصعترية؟ ما الذي يسبب الخلل الوظيفي في الخيوط الصعترية في المسنة وكيف يمكننا تحقيق إعادة تكوين الخلايا التائية في المختبر؟

تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في الاسترداد العالي للخلايا الجرثومية الإيمية المتغيرة ، والتخصيب غير المتحيز للخلايا الظهارية الإيمية ، والنقاء العالي الذي يمكن تحقيقه في النهاية عن طريق فرز الخلايا. لعزل الخلايا اللحمية الصعترية ، حدد أولا الغدة الصعترية ، التي تقع أسفل الأضلاع مباشرة وتبدو وكأنها فصين أبيضين رفيعين يعلوان القلب. ثم افصل النسيج الضام المحيط بالغدة الصعترية واستخدم ملقطا مسننا منحنيا لسحب الفصوص الصعترية وإزالتها برفق.

ضع الفصوص في صفيحة من ستة آبار تحتوي على خمسة ملليلتر من الوسط وقم بقص أي دهون محيطة وأنسجة ضامة. ثم نقل الفصوص المشذبة إلى بئر جديد يحتوي على خمسة ملليلتر من محلول الإنزيم المحضر حديثا واستخدم مقصا ناعما لعمل شقوق صغيرة في الأنسجة. ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية.

بعد 20 دقيقة ، قم بعمل ماصة الأنسجة برفق لأعلى ولأسفل عدة مرات باستخدام ماصة سعة خمسة ملليلتر لفصل الملاط في معلق خلية واحدة. اجمع الجزء الطافي في أنبوب سعة 50 مليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من المخزن المؤقت الغني بالألبومين البارد على الجليد لتحييد الإنزيمات. ثم أضف 2.5 مل من محلول الإنزيم إلى الأنسجة المتبقية.

احتضن الطبق لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتحريك الأنسجة برفق باستخدام حقنة سعة ثلاثة ملليلتر مزودة بإبرة 18 جينا لتفتيت أي مجاميع. ثم انقل إلى أنبوب التجميع.

ثم أضف 2.5 مل من محلول الإنزيم إلى الأنسجة المتبقية. احتضن الطبق لمدة 15 دقيقة. بعد الحضانة الثالثة ، كرر التحريض الميكانيكي بإبرة 20 5G.

بعد احتضان الأنسجة لمدة خمس إلى 10 دقائق أخيرة ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب التجميع للطرد المركزي لتحديد التقنية المستردة عن طريق قياس التدفق الخلوي باتباع إجراءات تلطيخ الأجسام المضادة القياسية ، قم بتشغيل العينات على مقياس تدفق خلوي متعدد المعلمات وقم بتحليل البيانات باستخدام برنامج تحليل الفاكس المناسب لإثراء التكنولوجيا بشكل أكبر باستخدام طريقة التحريك. أولا ، احتضان الخلايا بالجسم المضاد المناسب للتخصيب. بعد ذلك ، أضف تعليق الخلية إلى لوحة تحريك مشفرة مسبقا ثم قم بتدوير اللوحة وتحضنها في درجة حرارة الغرفة.

بعد 30 دقيقة ، قم بتدوير اللوحة بقوة ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب مخروطي الشكل. اشطف الطبق مرتين بغسالات طازجة ومتوسطة في أنبوب التجميع. ثم بعد تدوير الخلايا ، أعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من الطازجة والمتوسطة وانقل تعليق الخلية إلى لوحة تحريك جديدة ، وجمع الخلايا بعد الدوران والحضانة كما هو موضح للتو لزيادة تنقية التكنولوجيا المخصبة في مجموعات الخلايا الصعترية الفرعية.

بعد وضع العلامات بالأجسام المضادة المناسبة ، قم بفرز التقنية من خلال فوهة 100 ميكرومتر عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة ، وجمع الخلايا في 30٪ من الحجم لكل حجم FBS في المتوسط. في استراتيجية البوابات التمثيلية هذه لتحديد التكنولوجيا عن طريق قياس التدفق الخلوي ، يمكن ملاحظة التعبير عن epca ، ولكن ليس CD 45 بواسطة التكنولوجيا. وبالتالي ، يمكن أن تكون التكنولوجيا مسورة وفقا لتقنية التعبير ep و camm و CD 45 الخاصة بهم وتتكون من مجموعات فرعية ظهارية قشرية أو CEC ومجموعات فرعية ظهارية نخاعية أو mtech.

يمكن تمييز هذه المجموعات الفرعية بالجسم المضاد الحي 51 ، الذي يتعرف على G glutamyl amino peptidase المعبر عنه بواسطة ctec و lectin UEA one ، والذي يرتبط ب mtech كل من ctech و Mtech التعبير عن MHC Class Two على أسطحهما. على الرغم من أنه يمكن تصنيف mtech إلى مجموعات سكانية منخفضة mtech و mtech عالية ، اعتمادا على مستوى تعبير معقد التوافق النسيجي الكبير ، يمكن استرداد ما يقرب من ثماني مرات من التكنولوجيا باستخدام البروتوكول القائم على إنزيم liase الذي تم إثباته للتو مقارنة بالبروتوكول الذي يحتوي على مساحة الكولاجيناز والقرص بحوالي تسعة أضعاف 10 إلى الخامس ، ويمكن استردادها من غدة صعترية واحدة فقط لتقليل وقت الفرز وزيادة جدوى الخلايا اللحمية المستعادة. يمكن استخدام التحريك كما هو موضح للتو لاستنفاد مواقع الخلايا الصعترية مقارنة بخلايا الغدة الصعترية المحضرة بالكامل.

تزداد نسبة التكنولوجيا من أقل من 0.5٪ إلى أكثر من 15٪ في مجموعة الخلايا بعد التخصيب. بعد التحريك ، لا يتم تغيير نسب المجموعات الفرعية التقنية ، مما يشير إلى عدم فقد أي من المجموعتين الفرعيتين بشكل انتقائي أثناء التحريك. بالمقارنة مع عينة التخصيب البريين ، يبلغ معدل استرداد التكنولوجيا حوالي 85٪ بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إثراء الخلايا الجرثومية من أكثر من الذعر ، وكذلك كيفية تحديد وتنقية المزيد من الانحسارات الظهارية عن طريق قياس التدفق الخلوي.