شاشة عالية الإنتاجية الخميرة Overexpression البلازميد

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحويل خلايا الخميرة باستخدام مكتبة مصفوفة من الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNAs) الخاصة بالبلازما. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تنمية كمية مناسبة من خلايا الخميرة، ثم تُعالج خلايا الخميرة بخلات الليثيوم لجعلها كفؤة لعملية تحويل DNA.

بعد ذلك، يتم إجراء عملية تحويل الخلايا المختصة عن طريق خلطها مع الـ DNA. وتتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في اختيار وتحليل الخلايا المتحولة. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج توضح تأثيرات الـ DNA البلازميدي على الأنماط الظاهرية للخميرة من خلال اختبارات بقع الخميرة و/أو الفحص المجهري.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالبروتوكولات الحالية، مثل عمليات تحويل الخميرة القياسية، في أنها تسمح بتحويل عدد كبير من البلازميدات المختلفة إلى خلايا الخميرة بطريقة مؤتمتة. وقد صُمم بروتوكول تحويل الخميرة عالي الإنتاجية هذا لـ 10 أطباق ذات 96 بئراً، ولكن يمكن زيادة حجم العملية أو تقليله وفقاً لذلك. وفي التجارب ذات النطاق الأوسع، يكمن مفتاح النجاح في الحفاظ على تنظيم جميع الأطباق والكواشف.

بمجرد بدء التجربة وتفادياً للخلط، سيتم استخدام جهاز مناولة السوائل السريع Biobot rapid plate liquid handler في هذا البروتوكول. للبدء، يتم توزيع كمية تتراوح بين 5 إلى 10 µL من DNA البلازما من مكتبة بلازميدات الخميرة المصفوفية (array yeast plasmid library) في كل بئر من أطباق الآبار 96 ذات القاع المستدير. توضع أطباق الآبار 96 غير مغطاة داخل خزانة تدفق هوائي (clean bench fume hood) طوال الليل لتجف.

بعد ذلك، قم بتلقيح 200 ملليلتر من وسط مستخلص الخميرة والببتون والديكستروز (YPD) بسلالة الاستعلام في دورق Lin Meyer ذو حواجز سعة 500 ملليلتر، ثم حضنها طوال الليل عند 30 درجة Celsius مع الرج. وفي صباح اليوم التالي، خفف سلالة الاستعلام لتصل الكثافة الضوئية OD 600 إلى 0.1 في لترين من وسط YPD لضمان النمو الأمثل. قم بتنمية مزارع تصل سعتها إلى لتر واحد في دورق منفصلة ذات حواجز سعة 2.8 لتر.

رجّ الدوارق لمدة تتراوح من أربع إلى ست ساعات عند 30 درجة Celsius حتى تصل المزارع إلى قيمة OD 600 تتراوح بين 0.8 و 1.0. عندما تصل مزرعة الخميرة إلى قيمة OD 600 تتراوح بين 0.8 و 1.0، يتم حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي. املأ أربعة أنابيب مخروطية مخصصة للاستخدام مرة واحدة سعة 225 milliliter بالمزرعة، وقم بتدويرها بسرعة 3000 RPM لمدة خمس دقائق في جهاز طرد مركزي مكتبي.

اسكب السائل الطافي S من كل أنبوب. أضف المزيد من المزرعة إلى الأنابيب نفسها وقم بالطرد المركزي مرة أخرى، وكرر العملية حسب الضرورة حتى يتم جمع جميع الخلايا. اغسل كل كتلة خلوية في 50 milliliters من الماء المقطر المعقم بجهاز التعقيم (autoclave) وأعد تعليقها عن طريق الرج الدوامي (vortexing).

اجمع الخلايا في أنبوب مخروطي واحد بسعة 225 milliliter وقم بالطرد المركزي بسرعة 3000 RPM لمدة خمس دقائق. بعد إزالة السائل الطافي S، اغسل الخلايا في 100 milliliters من محلول خلات الليثيوم. قم بالطرد المركزي مرة أخرى بسرعة 3000 RPM لمدة خمس دقائق.

قم بإزالة SNA وأعد تعليق كتلة الخلايا في 70 milliliters من محلول خلات الليثيوم. استخدم جهاز الـ Vortex بسرعة عالية لمدة 30 ثانية تقريبًا حتى يتم إعادة تعليق الكتلة تمامًا. قم بالتحضين مع الرج عند 30 degrees Celsius لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك، أضف beta me capto ethanol إلى 0.1 molar وحضن الخليط مع الرج عند 30 درجة Celsius لمدة 30 دقيقة أخرى. وبعد انتهاء فترة التحضين التي استغرقت 30 دقيقة، أضف 2 milliliters من DNA سبرمن السلمون المغلي والمبرد إلى خليط الخلايا. صب خليط الخلايا في طبق أحادي البئر قابل للتعقيم بالبخار (autoclavable)، ثم قم بإزالة أي راسب يتكون لأن ذلك قد يتداخل مع عملية السحب بالماصة في الخطوات اللاحقة.

باستخدام جهاز biobot rapid plate، قم بتوزيع 50 µL من خليط الخلايا في كل بئر من أطباق الـ 96 بئراً الأربعة التي تم تحضيرها مسبقاً والتي تحتوي على DNA البلازما، مع مراعاة عدم الخلط. تُحضن الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة بدون هز أثناء فترة تحضين الخلايا.

قم بتحضير 200 milliliters من محلول PEG DMSO lithium acetate. اخلط 160 milliliters من 50%PEG 33, 50 مع 20 milliliters من DMSO و20 milliliters من lithium acetate بتركيز one molar. من المهم تحضير هذا المحلول مباشرة قبل الاستخدام.

أضف 125 µL من محلول PEG lithium acetate DMSO إلى كل منها. امزج جيداً عن طريق سحب وتوزيع معلق الخلايا ثماني مرات. احضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة دون رج.

بعد ذلك، قم بإجراء صدمة حرارية للخلايا عند 42 °C لمدة 15 دقيقة في حاضنة جافة، ولا تضع الأطباق فوق بعضها البعض بعد الصدمة الحرارية، ثم قم بتدوير الأطباق باستخدام محولات جهاز الطرد المركزي المناسبة لأطباق 96 بئرًا. وبعد عملية الطرد المركزي، تخلص من محلول PEG عن طريق قلب الأطباق فوق وعاء النفايات، ثم جفف الأطباق المقلوبة باستخدام مناشف ورقية.

لإزالة السائل المتبقي، ستظل الخلايا في قاع الآبار. اشطف الخلايا بإضافة 200 µL من الوسط الغذائي الأدنى (minimal media) إلى كل بئر. ثم قم بتدوير الأطباق مرة أخرى.

تخلص من الطافي عن طريق قلب الأطباق فوق وعاء النفايات والتجفيف باستخدام مناشف ورقية. أضف 200 µL من الوسط الغذائي الأدنى إلى كل بئر باستخدام ملقط توزيع سريع، ثم قم بالتحضين عند 30 °C لمدة يومين دون هز. بعد يومين، يجب أن تبدأ مستعمرات صغيرة من الخلايا في التشكل في قاع كل بئر تم تحويله بنجاح.

للاستعداد لمقايسة التبقع (Spatting assay)، قم أولاً بتوزيع 200 µL من الوسط الغذائي الأدنى القائم على OSE في كل بئر من بئر صفيحة 96 بئرية مسطحة القاع جديدة. بعد ذلك، اخلط محتويات كل بئر في صفيحة التحول عن طريق سحب وتوزيع معلق الخلايا ثماني مرات باستخدام ماصة سريعة.

قم بتلقيح كل بئر من أطباق الرافينوز بخمسة µL من خليط الخلايا من طبق التحول، ثم حضنها عند 30 °C لمدة يوم واحد. وفي اليوم التالي، يجب أن تظهر مستعمرات صغيرة في قاع كل بئر.

سنقوم بإجراء مقايسة التنقيط (spotting assay) داخل خزانة التدفق الصفحي، مع تعقيم مكرر 96 بئراً (96 bolt replicator) أو أداة "frogger" عن طريق التعريض للهب. اخلط المستعمرات باستخدام أداة "frogger" ثم قم بتنقيط المستعمرات على أطباق أوساط انتقائية. بعد التنقيط، اترك الأطباق لتجف داخل الخزانة لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق.

يتم تحضين الأطباق عند 30 درجة Celsius لمدة يومين إلى ثلاثة أيام. تظهر هنا نتائج نموذجية لفحص فرط تعبير بلازميد الخميرة لتحديد المثبطات والمعززات لسمية TDP 43. إن TDP 43 هو بروتين بشري يرتبط بنشوء التصلب الجانبي الضموري أو مرض لوس جيج، حيث يؤدي التعبير عن TDP 43 في خلايا الخميرة إلى التجمع والسمية الخلوية.

تظهر هذه الأطباق مستعمرات تحتوي على بلازميد T DP 43 مدمج وقابل للتحريض بواسطة الجالاكتوز، والتي تم تحويلها أيضاً ببلازميدات من مكتبة التعبير عن إطارات القراءة المفتوحة (ORF) لجين flex. وتظهر المستعمرات هنا باللون الأحمر لأن السلالة تعاني من طفرة تؤدي إلى تراكم صبغة حمراء. يحتوي الطبق الموجود على اليسار على الجلوكوز، الذي يعمل على كبح تعبير T DP 43 أو بلازميدات جين flex.

يحتوي الطبق الموجود على اليمين على الجالاكتوز، والذي يحفز التعبير عن TDP 43 و O Fs في بلازميدات جين flex. يشير رأس السهم الأخضر إلى مستعمرة تم تحويلها ببلازميد يثبط سمية TDP 43، وهو ما يتضح من النمو الأسرع والمستعمرات الأكثر كثافة. بينما يشير رأس السهم الأحمر إلى مستعمرة تم تحويلها ببلازميد يعزز سمية TDP 43، وهو ما يتضح من النمو الأبطأ والمستعمرات الأقل كثافة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحويل مكتبة تجنّبية من حمض DNA البلازمي من الخلايا.