الفيروسة البطيئة بوساطة التلاعب الجيني والتخيل من العصبونات الحسية الشمية في الجسم الحي

أحد تحديات دراسة التطور في علم الأعصاب هو رصد المورفولوجيا الشجيرية والمحورية على مستوى الخلية الواحدة داخل الجسم الحي. في الجهاز الشمي، تمد الخلايا العصبية الحسية الشمية محاورها من الظهارة الشمية في الأنف إلى البصلة الشمية في الدماغ. ومع توجّه العديد من الخلايا العصبية الحسية الشمية نحو البصلة الشمية، فإنها تتجمع في حزم.

يؤدي هذا إلى تعقيد دراسة مسارات المحاور العصبية الفردية ومورفولوجيا نهاياتها. لقد قمنا بتطوير طريقة لتصور الخلايا العصبية الحسية الشمية المفردة داخل الجسم الحي عن طريق الحقن المجهري لبنية GFP المحمولة على الفيروسات البطيئة.

يؤدي نقل الجينات الناجح باستخدام الفيروسات البطيئة (lentivirus) إلى إضاءة كامل طول المحوار الحسي الشمي، بما في ذلك التفرعات النهائية. وبالإضافة إلى تصور الخلايا العصبية الحسية الشمية المنفردة، تتيح لنا هذه الطريقة التحكم في التعبير الجيني لجين معين محل الاهتمام لدراسة وظيفته في سياق حي (in vivo). وتُصنف هذه الإجراءات الخاصة بالفيروسات البطيئة ضمن المستوى الثاني من السلامة البيولوجية، ويجب تنفيذها داخل غطاء تدفق صفائحي.

للحفاظ على بيئة معقمة، قم برش كل ما يتم إدخاله إلى غطاء التدفق الصفائحي بـ 70% ethanol داخل الغطاء، ثم قم بتحضير وتسخين حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل الحقن. قم بإغلاق كيس تخزين بلاستيكي ممتلئ جزئيًا بالماء وضعه على حاضنة كتلة تسخين فارغة.

سيتيح ذلك للفئران التعافي بعد الحقن. املأ حاوية نفايات المخاطر البيولوجية بتركيز 10% من المبيض لتطهير جميع المواد التي تعرضت للفيروس. من هذا الإجراء، قم بتجهيز طبق مفتوح صغير يحتوي على 70% ethanol وطبق ثانٍ يحتوي على ماء مقطر معقم.

في غطاء التدفق الصفائحي، سنستخدم محقنة Hamilton بسعة 5 µL مع إبرة مقاس 33 gauge. يتيح هذا الطراز تحديداً ضبط مقاومة المكبس عن طريق تدوير قرص شد موجود في الجزء العلوي من غرفة المكبس. وتوفر هذه الميزة تحكماً في حجم الحقن المجهري لتعقيم الإبرة وغرفة المحقنة.

قم بسحب الإيثانول وطرده من الطبق عدة مرات بشكل متكرر. اشطف خرطوشة المحقنة عن طريق سحب وطرد الماء المعقم عدة مرات. ضع المحقنة جانباً بأمان داخل غطاء التدفق الصفائحي.

ضع مسحات الكحول بالقرب من محطة الحقن. قم بتجهيز منصة حقن توفر سطحاً مرتفعاً من شأنه أن يسهل وضع الفأر. يمكن استخدام طبق زراعة مقلوب بقطر 10 centimeter ومغطى بـ Kim wipes.

يمكن تخدير جراء الفئران عن طريق التبريد حتى سن الفطام. اقطع إصبعًا من قفاز مطاطي وضع جرو الفأر داخله، ثم ضعه على الثلج لمدة خمس دقائق.

سيمنع القفاز الحروق الجلدية التي قد تحدث نتيجة التلامس المباشر للجلد مع اختبار الثلج للتأكد من التخدير التام عن طريق قرص الجزء الخلفي من الجرو وأقدامه الأربعة للتأكد من عدم استجابة الحيوان. نحن الآن مستعدون للحقن المجهري للفيروس البطيء (lentivirus). سنقوم بالعرض باستخدام جرو حديث الولادة.

إذا تم استخدام فئران في عمر أكبر، فيجب استبدال الإبرة ذات القياس 33 بإبرة ذات قياس أكبر من أجل اختراق سطح الجمجمة. قم بتعقيم سطح أنف الفأر عن طريق مسحه بمسحة كحولية. أخرج مخزونات الفيروسات البطيئة (lentivirus) من وحدة التخزين المجمدة واتركها تذوب على الثلج.

لقد قمنا بإنتاج الفيروس lentivirus في المختبر بأنفسنا باستخدام طرق معتمدة. وأثناء تطوير هذه الطريقة، وجدنا أن الحد الأدنى من عيار الفيروس يجب أن يكون 10⁹ وحدات معدية لكل مل لضمان الحصول على معدل ترانسدكشن (transduction) جيد. اسحب 2 µL من محلول lentivirus المخزون باستخدام سرنجة Hamilton المعقمة.

ضع جرو الفأر فوق منصة الحقن. أمسك الجلد الموجود أعلى الرأس عند الأذنين، واسحبه للخلف برفق. لقد قمنا بتجهيز غطاء التدفق لدينا بمجهر تشريحي.

من أجل توجيه الحقن المجهري بدقة، ابحث في سطح الجمجمة الظهري عند الدماغ الأمامي عن مخطط للبصلة الشمية. تحيط أهداف الحقن المجهري لدينا بالبصلة الشمية بشكل وثيق، ولكن يجب ألا تشمل البصلة نفسها. نقوم بإجراء أربع عمليات حقن في الظهارة الشمية لكل جرو.

تتطلب هذه المواضع الممثلة بنقاط زرقاء إدخال الإبرة بزاوية موجهة إنسياً. أما الحقنتان الإضافيتان الممثلتان بنقاط خضراء فهما متدرجتان، وتكونان في موقع أكثر إنسية وأمام البصلة الشمية. ويمكن توجيه هذه الحقنات بزاوية متوافقة.

تم تقديم الاقتراحات الخاصة بزوايا الإبرة مع مراعاة الموضع البطني للظهارة الشمية، والتي تقع في الغالب أسفل البصلة الشمية. وبذلك يكون الوصول العمودي مقيداً. أدخل الإبرة عبر الجزء العلوي من التجويف الأنفي على عمق حوالي ثلاثة مليمترات تحت سطح الجلد.

للوصول إلى الظهارة الشمية. يجب أن يشعر الممارس المتمرس بانخفاض المقاومة عند الوصول إلى المساحة اللمعية للتجويف الأنفي. ينبغي تجنب هذه المنطقة.

قم بحقن 0.5 µL من محلول الفيروس المخزون مجهرياً في كل موضع. مرة أخرى، باختيار موقعين في كل جانب، الأيسر والأيمن، ليكون المجموع أربع حقنات بحجم 0.5 µL. وهذا يعني أن كل فأر يتطلب ميكرولترين من الفيروس في جلسة حقن واحدة.

مرة أخرى، احرص على عدم ترك أي محلول فيروسي متبقٍ أو دم قد يتسرب من موقع الحقن أو فتحات المنخرين عند تجفيف لطخة البصلة الشمية. استخدم مسحة إيثانول، وتخلص من المسحات في حاوية المبيض السائل المخفف، ثم ضع الفأر المحقون فوراً على حاضنة السرير المائي للتعافي. قم بتطهير الإبرة والمحقنة بتكرار إجراء التعقيم الذي تم تنفيذه أثناء التحضير. يمكن إعادة الفئران المحقونة إلى أقفاصها بعد مرور 30 دقيقة من التعافي على حاضنة السرير المائي.

يمكن تكرار عملية الحقن المجهري هذه بالكامل مرة أخرى بعد أربع ساعات. وإذا كنت ترغب في زيادة عدد العصبونات الحسية الشمية التي سيتم إصابتها، فيمكن رؤية العصبونات الحسية الشمية المصابة على طول الخلية في غضون ثلاثة أيام فقط. يتم تضحية الحيوانات وإجراء التروية لها للملاحظة عند النقطة الزمنية المطلوبة.

باستخدام الطرق القياسية، ومن أجل تصور مسارات الخلايا العصبية الحسية الشمية المنفردة المنقولة ونهايات المحاور العصبية، نقوم بتشريح البصلة الشمية وتقطيعها إكليلياً بسماكة 60 ميكرون. وبذلك سيحتوي المقطع على جميع طبقات الخلايا في البصلة الشمية، بما في ذلك حزم المحاور العصبية للخلايا العصبية الحسية الشمية، والنهايات المحورية التي تشكل مشابك عصبية في الهياكل الكبيبية الموجودة على سطح البصلة، وذلك تحضيراً لإجراء الكيمياء النسيجية المناعية العائمة. يتم عمل مقاطع متسلسلة من البصلة الشمية وتُجمع معاً في طبق زراعة قطره 10 سنتيمتر يحتوي على خمسة ملليلتر من المحلول الملحي المنظم بالفوسفات.

انقل المقاطع العائمة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter. بمجرد استقرار المقاطع في قاع الأنبوب، قم بسحب المحلول الملحي المنظم بالفوسفات باستخدام الشفاط. توخَّ الحذر لضمان عدم سحب المقاطع.

قم بتعويض المقاطع بـ 10 milliliters من محلول منظم طازج لغسل أي مواد تثبيت أو طمر متبقية. انقل هذا المعلق فوراً باستخدام الماصة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter، مع التأكد من التقاط جميع المقاطع العائمة، ثم قم بشفط محلول الشطف باستخدام المكنسة الكهربائية، ونفذ عملية النفاذ للمقاطع باستخدام محلول 0.3% Triton X 100 في محلول ملحي منظم بالفوسفات، وضع الأنبوب على منصة هزازة لمدة 10 دقائق. في درجة حرارة الغرفة، يمكنك بعد ذلك المتابعة من خلال بروتوكول صبغ مناعي قياسي في نفس الأنبوب المخروطي، مع تكرار خطوات الشفط والهز حسب الحاجة لهذا الحجم من الأوعية، مع الاحتفاظ بحجم 10 milliliter لخطوات الصبغ والشطف.

فيما يلي قائمة بالأجسام المضادة التي نستخدمها للصبغ المشترك للعصبونات الحسية الشمية التي تم نقل الجينات إليها بنجاح، ومجمل مجموعة العصبونات الحسية الشمية. ولضمان التغلغل الكامل للأجسام المضادة في مقاطع البصلة الشمية التي يبلغ سمكها 60 ميكرون، يُوصى بالتحضين طوال الليل عند درجة حرارة أربعة درجات مئوية. كما يجب ألا تقل مدة كل عملية غسل عن 20 دقيقة.

افرد كل مقطع برفق على شريحة زجاجية باستخدام فرشاة رسم، ثم قم بتثبيت كل شريحة باستخدام flora Mount G المكمل بمحلول صبغة الكروماتين. ابذل جهداً للتخلص من جميع الفقاعات الموجودة في وسط التثبيت. رتّب المقاطع في صفوف لتبسيط خطوة الفحص اللاحقة.

افحص هذه الطبقات في مقاطع البصيلات المصبوغة مناعيًا للبحث عن ألياف المحاور والنهايات الموجبة لبروتين GFP. وباستخدام مجهر فلوري، يمكن بعد ذلك تصوير النهايات العصبية المصابة إيجابيًا بواسطة المجهر البؤري (confocal microscopy). ومن المفيد معايرة المستوى البؤري في المنطقة المستهدفة باستخدام قنوات DPI وبروتين علامة الشم (olfactory marker protein).

تظهر هذه النتائج ليفاً واحداً لمحور عصبون حس شمّي ونهاية محورية داخل الكبيبة الشمّية، حيث يظهر البروتين الواصم الشمي باللون الأحمر، بينما يظهر vlu two باللون الرمادي؛ كما يمكن تصور أجسام خلايا العصبونات الحسية الشمّية المصابة وعقدها الشجيرية ضمن الظهارة الشمّية إذا تضمن التشريح وخطوات التلوين المناعي هذا النسيج. يوفر لنا هذا الإسقاط البؤري تفاصيل دقيقة للغاية لمورفولوجيا مسار امتداد محوري وشجرة نهايات عصبون حسي شمّي واحد. ويمكن ملاحظة التفاف ليف المحور عائداً نحو هدفه في الكبيبة، بالإضافة إلى تفاصيل نمط تفرعه داخل الشبكة العصبية للكبيبة.

تتيح طريقة الحقن المجهري للفيروسات البطيئة رؤية محور الخلية الواحدة ومورفولوجيا الخلايا العصبية الحسية الشمية، كما تسمح بإجراء دراسات تتحكم في التعبير الجيني؛ حيث يؤدي نقل الفيروس البطيء إلى دمج مستقر للمبنيات الجينية في الجينوم. ولا يقوم الفيروس البطيء بإصابة الخلايا المجاورة عبر التشابكات العصبية. ويمكن تحقيق التصور في غضون ثلاثة أيام فقط، وقد تأكد استمراره لمدة ثلاثة أشهر على الأقل، ومن المرجح أن يستمر لفترات أطول.

لا تُصاب العصبونات الحسية الشمية بسهولة عن طريق التسريب الأنفي لمحلول الفيروس البطيء (lentivirus). لذلك، يتطلب هذا الإجراء الحقن المجهري عبر السطح. وبذلك يكون هذا هو إجراء الحقن المجهري للفيروس البطيء.

آمل أن تكون قد وجدت كل هذه المعلومات مفيدة في سبيل تحقيق مورفولوجيا الخلية الواحدة الخاصة بك. تمنياتي لك بالتوفيق في تجاربك.