ومنصة عالية الإنتاجية الآلي للتنمية في خطوط التصنيع لخلية التداوي البروتين

الهدف العام من هذا الإجراء هو تطوير خطوط خلايا تصنيعية للمستحضرات البيولوجية تتميز بالنسلية والإنتاجية العالية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق ترانسفكشن الخلية المضيفة بالـ DNA الذي يشفر الجين المستهدف. الخطوة التالية من الإجراء هي عزل المستعمرات عالية الإنتاج عن طريق الفرز، يليه توثيق تكوين المستعمرات باستخدام جهاز Clone Select Imager.

تتمثل الخطوة النهائية في فحص واختيار المستنسخات عالية الإنتاجية. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر إنتاج الأجسام المضادة في المزارع المستمرة ومزارع الدفعة المغذاة عن طريق تقنية الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء ذات الطور المعكوس (reverse phase HPLC). ويعد عرض توضيحي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية نظراً لأن خطوات الفرز و pcan 80 dgl يصعب تعلمها بسبب الإعداد المعقد الذي تتطلبه هذه الإجراءات؛ لذا سيقوم العلماء التاليون من المختبر بشرح هذه الإجراءات: Jason Sanders لعملية ترانسفكشن الخلية المضيفة والفرز وتوثيق تكوين المستعمرات، و Russell Kan لأخذ عينات tecan.

لبدء هذا الإجراء قبل يوم واحد من عملية ترانسفكشن (Transfection)، يتم استزراع الخلايا المضيفة في قارورة زراعة خلايا تحتوي على 15 milliliters من وسط النمو. تُحضن الخلايا في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C و 7.5% carbon dioxide. وفي اليوم التالي، يتم تحضير معقدات الترانسفكشن؛ أولاً، يتم تخفيف 8 µg من DNA في 800 µL من وسط نمو خالٍ من السيروم في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم مع الخلط بلطف. بعد ذلك، يتم تخفيف 40 µL من Lipofectamine في 800 µL من وسط نمو خالٍ من السيروم في أنبوب بوليستيرين.

أضف الحمض النووي DNA المخفف إلى Lipofectamine المخفف. امزجهما برفق واتركهما للحضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتهيئة الخلايا المضيفة لعملية عفن الخلية (transfection). قم بإزالة وسط النمو من الخلايا واستبدله بـ 6.4 milliliters من وسط النمو الخالي من المصل.

أضف 1.6 milliliters من معقدات عفن التحويل (transfection complexes) إلى القارورة. امزج بلطف عن طريق هز القارورة. قم بحضن الخلايا عند 37 degrees Celsius في حضانة ثاني أكسيد الكربون لمدة ست ساعات.

بعد مرور ست ساعات، أضف ثمانية ملليلترات من وسط النمو إلى الدورق، ثم حضّنه عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون طوال الليل وفي اليوم التالي. أزل الوسط عن طريق الشفط وأضف وسط نمو جديداً إلى الدورق. حضّن الخلايا مرة أخرى طوال الليل بعد فترة التحضين الليلية الأولى.

استبدل وسط النمو بوسط الانتخاب. قم بتحضين الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة تتراوح بين أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع. بعد مرور أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع من عملية عفن الخلايا، تصبح الخلايا جاهزة للاستنساخ عن طريق فرز الخلايا المنشط بتدفق القياس الخلوي؛ قم بفصل الخلايا من القارورة وطردها مركزياً بسرعة 800 RPM لمدة خمس دقائق عند 4 درجة مئوية.

أعد تعليق الخلايا في وسط الانتخاب، المضاف إليه 2% bovine serum albumin. ثم أضف جسم مضاد anti-human IgG مُسمى فلورياً. أضف تخفيفاً بنسبة 1 إلى 20، وحضن الخليط على الثلج لمدة تتراوح من 15 إلى 30 دقيقة، ثم اغسل مرتين بـ PBS بارد، وأعد تعليق الخلايا في 1 XPBS في أنبوب بولي بروبيلين.

تظهر هذه الصورة مثالاً للخلايا المصبوغة من أجل الفرز العقيم باستخدام جهاز BD FACS Aria؛ قم بتجهيز طبق زراعة خلايا مكون من 96 بئراً يحتوي كل بئر منها على 200 µL من وسط الانتخاب. قم بتحميل الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا بطريقة عقيمة وحللها باستخدام جهاز BD FACS Aria، ثم سجل النتائج للخلايا المصبوغة وغير المصبوغة على التوالي.

قم بضبط البوابات والإعدادات لفرز الخلايا المفردة ذات ملف التلوين الفلوري المطلوب في طبق يحتوي على 96 بئراً، ثم حضّن الطبق في حضانة عند 37 °C لمدة أسبوعين؛ في اليوم صفر، واليوم الثالث، واليوم السابع، واليوم 13. بعد عملية الفرز، قم بتوثيق تكوين المستعمرات في طبق الـ 96 بئراً باستخدام جهاز تصوير اختيار النسائل لضمان اختيار النسائل المشتقة من خلية مفردة، وذلك لفحص واختيار النسائل عالية الإنتاجية. أولاً، قم بتوثيق موضع العينة في طبق مقايسة الاستقبال المكون من 96 بئراً. ثم استخدم نظاماً آلياً لنقل السوائل لنقل حصص قدرها 20 µL من المادة الطافية إلى كل بئر من آبار طبق المقايسة المكون من 96 بئراً. يتم تحليل إنتاج الأجسام المضادة في العينات بواسطة مقايسة ساندوتش.

يتم الكشف عن IgG البشري باستخدام مقايسة ELI SA على نظام تداول السوائل بالطريقة التالية. أولاً، يتم تحميل العينات ومعيار قياسي على ألواح مقايسة bio coat المضادة لـ IgG البشري والمكودة مسبقاً. تُحضن الألواح في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين، يلي ذلك ثلاث غسلات بمحلول PBS.

يُضاف الجسم المضاد Goat anti-human IgG-HRP من نوع ImmunoPure إلى الأطباق بتخفيف 1:2000، وتُحضن الأطباق لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. وبعد مرور ساعة واحدة، تُغسل الأطباق ثلاث مرات باستخدام PBS، ثم يُضاف ركيزة ABTS.

أخيرًا، تُقرأ الأطباق باستخدام قارئ الأطباق عن طريق قياس الامتصاصية عند 405 nanometers للكشف. وباستخدام هذه المنصة الآلية، وُجد أن مستوى الأجسام المضادة السطحية، والذي ينعكس من خلال التلوين باستخدام anti-human IgG المسمى فلوريًا، يتناسب مع إنتاجية الأجسام المضادة للخلية. وكما هو موضح هنا لأفضل نسيلتين تم إنتاجهما من المجموعة الخلوية ذات التعبير العالي للأجسام المضادة السطحية، تراوحت الإنتاجية النوعية من 50 إلى 70 picograms لكل خلية في اليوم.

وفي المقابل، بلغت إنتاجية الأجسام المضادة حوالي 20 picograms لكل خلية في اليوم بالنسبة لأفضل اثنين من المستنسخات الناتجة عن مجموعة الخلايا ذات التعبير المنخفض للأجسام المضادة السطحية. علاوة على ذلك، فإن الخطوط الخلوية التي تم تطويرها عن طريق الفرز بتقنية fact تعد أكثر استقراراً فيما يتعلق بإنتاج الأجسام المضادة مقارنة بتلك التي تم استنساخها من خلال التخفيف المحدود اليدوي. وقد انخفضت الإنتاجية النوعية لأفضل مستنسخ وهو المستنسخ الأول الناتج عن التخفيف المحدود اليدوي من حوالي 30 PCD إلى حوالي 10 PCD بعد الزرع لمدة 80 مضاعفة خلوية.

من ناحية أخرى، تمكن المستنسخ الفرعي الأعلى الذي تم إنتاجه بواسطة فرز FACS للمستنسخ اثنين من الحفاظ على إنتاجية نوعية تبلغ حوالي 20 PCD على الأقل لمدة 100 تضاعف خلوي. وقد أظهر تحديد موقع دمج الجين المنقول في كروموسوم الخلية عن طريق التهجين الموضعي المتألق (FISH) أن المستنسخ واحد يمثل مجتمعاً مختلطاً من النمط الظاهري A والنمط الظاهري B. وفي المقابل، ظهر المستنسخ الذي تم فرزه بواسطة FACS كمجتمع أكثر تجانساً، حيث كانت 99.5% من الخلايا من النمط الظاهري A. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك رؤية جيدة حول كيفية تطوير خطوط خلوية تصنيعية لإنتاج البروتينات العلاجية.