مختبر تقنيات العقيم: طرق تصفيح

[الراوي] يتضمن هذا البروتوكول استخدام التقنيات التعقيمية في طرق الزرع المستخدمة لعزل الكائنات الدقيقة، أو إكثارها، أو تعدادها، مثل البكتيريا والعاثيات (phage). وتشمل الإجراءات طريقة الزرع بالتخطيط لمزارع بكتيرية لعزل مستعمرات مفردة، وطريقة الزرع بالصب لتحديد تركيز البكتيريا، وطريقة الزرع بالنشر لتعداد المستعمرات البكتيرية الحية. وتُستخدم طبقات الأجار الرخوة لعزل العاثيات وتعداد اللويحات (plaques)، بينما تقوم طريقة الزرع بالتكرار بنقل الخلايا من طبق إلى آخر بنمط مكاني متطابق. وفي نهاية المطاف، تتنوع التطبيقات العملية لهذه التقنيات في استزراع الكائنات الدقيقة بدءاً من تحديد هوية البكتيريا في البيئات وصولاً إلى التقدم التكنولوجي في الوراثة الجزيئية والمقايسات الحيوية عالية الإنتاجية.

- بشكل عام، قد يواجه الأشخاص الجدد في طرق الزرع هذه صعوبة لأن العمليات تتطلب حركات دقيقة ومنسقة لتجنب ملامسة الأسطح غير المعقمة. ويتطلب تعلم هذه الإجراءات الروتينية تدريباً وممارسة. وسيقوم منسق المختبر، الدكتور Kris Reddi، بتوضيح هذه الإجراءات.

- [Narrator] ابدأ العمل مع الكائنات الدقيقة بمعرفة قواعد المختبر واحتياطات السلامة، بما في ذلك تصنيف المخاطر البيولوجية، وتطهير النفايات، والتخلص منها. تأكد من أن جميع الأدوات والمحاليل والأوساط المستخدمة في إجراءات الزرع معقمة. قم أيضًا بتجهيز مساحة عمل واضحة، ونظفها بمطهر. جهز موقد بنزن متصلاً بخط الغاز، ورتب المستلزمات الضرورية مع وضع ملصقات تعريفية مناسبة على المواد. انتقل إلى غسل اليدين جيداً بصابون مطهر وماء دافئ؛ ابدأ بترطيب اليدين بماء دافئ جارٍ، ثم ضع الصابون ووزعه جيداً. افرك اليدين بقوة لإحداث احتكاك على جميع الأسطح بما في ذلك الإبهام، وظهور الأصابع، وظهر اليدين، وتحت الأظافر. ثم اشطفهما جيداً لإزالة بقايا الصابون وجففهما باستخدام مناشف ورقية من الحامل. وأخيرًا، باستخدام منشفة ورقية نظيفة، أغلق الصنبور. تم تصميم إجراء طبق التخطيط (Streak Plate) لعزل مستنبتات نقية من البكتيريا، أو مستعمرات، من مجموعات مختلطة عن طريق الفصل الميكانيكي البسيط. أخرج طبق أغار من صندوق تبريد بدرجة حرارة 4 °C واتركه ليصل إلى درجة حرارة الغرفة. اختر أداة من مجموعة الأدوات لتخطيط الطبق. تأكد من أن الطبق جاف ولا يوجد تكثيف على الغطاء. ضع علامة تعريفية على قاع طبق الأغار حول الحافة. عند إتقان العملية، يمكن استخدام طبق واحد لعينات متعددة. ثم أشعل موقد بنزن لتعقيم الحلقة المعدنية باللهب. ابدأ على مسافة ثلاث إلى أربع بوصات من الحلقة المعدنية مع وضع السلك في طرف المخروط الأزرق، وهو الجزء الأكثر سخونة في لهب موقد بنزن. عندما يصبح المعدن ساخناً لدرجة الاحمرار، حرك السلك بحيث يقترب اللهب من الحلقة. لتبريد الحلقة، المس حافة وسط الأغار مما يُحدث صوت أزيز. استمر في التقاط اللقاح على الحلقة. ارفع النصف السفلي من الطبق. حرك الحلقة ذهاباً وإياباً من الحافة إلى المركز في الربع الأول من الطبق. ضع الطبق المقلوب مرة أخرى على الغطاء. أعد تعقيم الحلقة المعدنية باللهب. أدر طبق بتري بزاوية 90 درجة. المس الحلقة بالقرب من نهاية آخر تخطيط باستخدام نمط الذهاب والإياب، بحيث تتقاطع مع النصف الأخير من التخطيطات في الربع الأول، ثم انتقل إلى الربع الثاني الفارغ. بمجرد امتلاء الربع الثاني، ضع الطبق. كرر إجراء التخطيط للربعين الثالث والرابع مع تجنب الاتصال بالربع الأول. للتخطيط باستخدام عود أسنان معقم ومسطح، أمسك الطرف الضيق بلطف بين الإبهام وبنصر اليد بزاوية 10 إلى 20 درجة بالنسبة للوسط، واستخدم الطرف العريض لتخطيط الأرباع. اقلب الطبق على الغطاء بين الأرباع وتخلص من عود الأسنان بشكل مناسب. انتقل إلى تحضين الأطباق المخططة وهي مقلوبة. يقوم إجراء الطبق المصبوب (Pour Plate) بتعداد العدد الإجمالي للوحدات المكونة للمستعمرات على السطح وداخل أغار طبق واحد. اضبط المؤقت لمدة 10 دقائق، ثم انقل 18 mL من وسط الأغار المذاب من حمام مائي بدرجة حرارة 55 °C إلى كتلة تسخين بدرجة حرارة 48 °C واتركها تتوازن لمدة 10 دقائق. ضع علامة تعريفية على قاع طبق بتري معقم. وإذا كان ذلك مناسباً، أضف عامل التخفيف. الآن صب 1 mL من العينة في منتصف طبق بتري. أغلق الغطاء. انزع الغطاء عن أنبوب الأغار المذاب ومرر حافة الأنبوب المفتوح عبر اللهب. صب الأغار بعناية في طبق بتري. أغلق الغطاء ثم اخلط العينة مع الأغار عن طريق تدوير الطبق بلطف. انتظر لمدة 30 دقيقة للسماح للأغار بالتصلب. بمجرد تصلب الأغار، اقلب الطبق وضعه في غرفة دافئة. يهدف زرع النشر (Spread-plating) إلى فصل الكائنات الدقيقة الموجودة في حجم عينة صغير وتوزيع المستعمرات الناتجة بالتساوي عبر سطح الأغار. وازن الطبق في درجة حرارة الغرفة وضع العلامات المناسبة. ضع الطبق على القرص الدوار. استخدم الماصة لنقل 0.1 mL من العينة إلى مركز الأغار وأغلق الغطاء. تخلص من طرف الماصة في حاوية النفايات. اغمس القضيب المعدني في بيكر يحتوي على 70% إيثانول بحيث يغطي الجزء السفلي بالكامل من الناشر وبوصة واحدة من الساق، ثم صرّفه. أشعل الإيثانول الزائد بتمريره عبر لهب موقد بنزن. بعد ذلك، افتح غطاء طبق الأغار وبرد الناشر بلمسه إلى الأغار على طول الحافة القريبة من الإطار. أدر القرص الدوار ببطء. مع تثبيت الناشر بلطف على سطح الأغار، انشر العينة تدريجياً وبالتساوي على كامل الطبق باستخدام حركة ذهاب وإياب أثناء دوران القرص الدوار. أغلق الغطاء واترك العينة تمتص تماماً لمدة خمس دقائق على الأقل. ثم، حضن الطبق المقلوب. أولاً، ضع علامة تعريفية مناسبة على طبق الأغار. افتح غطاء طبق الأغار. ثم افتح حاوية الخرز الزجاجي المعقم مسبقاً وعقم الحافة باللهب. وزع بعناية من 10 إلى 12 خرزة زجاجية معقمة على طبق أغار. أغلق غطاء الطبق وعقم حافة حاوية الخرز الزجاجي قبل استبدال الغطاء. الآن، استخدم الماصة لنقل العينة إلى مركز الأغار. بحركة أفقية، هز الخرز بلطف عبر سطح الأغار سبع مرات. إذا تم ذلك بشكل صحيح، فإن الإجراء يصدر صوتاً يشبه هز الماراكاس. أدر الطبق بزاوية 60 درجة وهزه أفقياً مرة أخرى سبع مرات. مجدداً، أدر الطبق 60 درجة وكرر الهز. تأكد من امتصاص العينة. ثم، صب الخرز الملوث في بيكر تجميع محدد يحتوي على 10% مبيض الكلور. حضن الطبق المقلوب. يُستخدم مقايسة اللويحات (plaque assay) عادةً للكشف عن البكتيريوفاج وتحديده كمياً. استنبت البكتيريا الدليلية حتى المرحلة الأسية وخزنها على الثلج. ثم، ضع علامة تعريفية على أنبوبي طرد مركزي دقيق معقمين باسم "فاج" و"ضابط" وأضف 50 µL من عينة الفاج أو المنظم (buffer) على التوالي إلى كل منهما. بعد ذلك، حرك المزرعة البكتيرية في الدورق، ثم انقل جزءاً من البكتيريا إلى أنبوب معقم وقم بعمل vortex لطيف للبكتيريا الدليلية، ثم أضف 500 µL من البكتيريا إلى كل أنبوب امتصاص. اخلط عن طريق نقر الأنابيب بلطف. لا تقم أبداً بعمل vortex أو استخدام الماصة بقوة مع عينات الفاج. حضن خليط الفاج والبكتيريا في درجة حرارة مناسبة للسلالة الدليلية لمدة 20 دقيقة. وفي هذه الأثناء، انقل أنبوبين من الأغار الرخو من حمام مائي بدرجة حرارة 55 °C إلى كتلة تسخين بدرجة حرارة 48 °C. وازنهما لمدة 10 دقائق. جهز طبقين أغار مغذٍ صلب خالٍ من التكثيف وموزانين مسبقاً في درجة حرارة الغرفة. أخرج أنبوب أغار رخو من كتلة التسخين وتأكد من أن المحتويات ليست ساخنة جداً عند لمسها. بعد ذلك، انقل الخليط بطريقة معقمة من أنبوب امتصاص الفاج إلى أنبوب الأغار الرخو. ثم، قم بتدويره بسرعة بين راحتي اليد لخلط المحتويات. مع إمساك الأنبوب في يد واحدة، افتح غطاء طبق الأغار الصلب باليد الأخرى. صب جميع محتويات الأنبوب على الفور على سطح طبق الأغار الصلب. هز الطبق بسرعة وبلطف. أغلق الغطاء وضع الطبق على سطح مستوٍ لمدة 30 دقيقة حتى يتصلب الأغار الرخو. بعد ذلك، كرر الإجراء لأنبوب امتصاص الضابط عن طريق نقل الخليط الضابط إلى أنبوب أغار رخو. خلطه، وصب المحتويات على طبق أغار صلب، وهزه، والسماح للأغار الرخو بالتصلب لمدة 30 دقيقة. افحص الأطباق بحثاً عن تكوين اللويحات. لعزل لويحة من خليط غير متجانس، اثقب المركز بعناية باستخدام عود أسنان معقم وانقل اللقاح إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم يحتوي على 100 µL من منظم الفاج. استمر في تنقية هذا الراشح (lysate) بتكرار مقايسة اللويحات من ثلاث إلى ست مرات مع تخفيفات متسلسلة حسب الضرورة. يستغل الزرع المتكرر (Replica plating) النمط الظاهري القابل للاختيار من خلال السماح بمقارنة نمو الخلايا على طبق أولي بأطباق ثانوية. ارسم شبكة على قاع الطبق، وضع علامة على الطبق الأولي، ورقّم المربعات الناتجة. الآن، استخدم تقنية معقمة لإزالة عود أسنان معقم مسبقاً من البيكر، والمس مركز كل مربع بعينة خلوية، وتخلص من عود الأسنان في وعاء نفايات مناسب. حضن الطبق الأولي. ضع الطبق الأولي وفوقه جميع الأطباق الثانوية. ضع علامة توجيه على جانب النصف السفلي من الأطباق. الآن انزع قطعة قماش مخملية معقمة من غلافها وضعها على الكتلة الأسطوانية. بعد ذلك، ضع الحامل مع محاذاة العلامات الموجودة على الحامل مع تلك الموجودة على الكتلة. لاحظ علامة التوجيه على الكتلة والحامل. بعد ذلك، انزع الغطاء من الطبق الأولي. قم بمحاذاة علامات التوجيه على الطبق والكتلة. اخفض الطبق بحيث يتلامس سطح الأغار مع القماش المخملي. باستخدام أطراف الأصابع، اضغط بخفة ولكن بالتساوي على ظهر الطبق الأولي ثم ارفعه بعناية عن الكتلة. تأكد من إمكانية رؤية طبعة الخلايا على المخمل. أعد الغطاء إلى الطبق. الآن، كرر البروتوكول بالتتابع على القماش المخملي مع كل طبق من الأطباق الثانوية. استخدم طبعة الخلايا المخملية من الطبق الأولي لتلقيح ما يصل إلى ثمانية أطباق ثانوية مرتبة من الركيزة الأقل ملاءمة إلى الأكثر ملاءمة. وأخيراً كضابط إيجابي، بالنسبة لآخر طبق في السلسلة، استخدم وسط أغار يجب أن تنمو فيه جميع السلالات المختبرة. ألصق الأطباق المقلوبة معاً وحضنها. افحص الأطباق الثانوية للبحث عن نمو. أطفئ موقد بنزن ثم ضع جميع المستلزمات في مكانها. ضع الملابس المخبرية الملوثة والأدوات الزجاجية والنفايات الخطرة في وعاء التخلص المناسب. نظف منطقة العمل بمطهر. وأخيراً، اغسل اليدين جيداً بصابون مطهر وماء دافئ. تعتبر Serratia Marcescens بكتيريا سالبة الغرام، عصوية الشكل من البروتوبكتيريا التي تنتج صبغة حمراء تسمى prodigiosin. وتوجد عادةً وهي تنمو في الحمامات وعلى ستائر الدش. في هذا المثال، تولد تقنية طبق التخطيط مستعمرات فردية في الربع الرابع. يستخدم هذا التحليل للبكتيريا الموجودة في عينة مياه تم جمعها من نافورة شرب عامة تقنية الطبق المصبوب. لاحظ الفرق في مظهر المستعمرات؛ المستعمرات السطحية كبيرة ودائرية الشكل بينما تكون بعض المستعمرات السطحية صغيرة جداً وغير منتظمة الشكل. تعتبر تقنية طبق النشر مكوناً مهماً في تجارب الإثراء والاختيار والمسح. على سبيل المثال، تعد طريقة copacabana أداة تمييز في الفحص الكلاسيكي الأزرق-الأبيض في تقنية الحمض النووي معاد التركيب (recombinant DNA). الفاج T4 هو فاج DNA مزدوج السلسلة شديد الضراوة يصيب مضيفه Escherichia coli لتحليله وإطلاق الفاجات الناتجة. تظهر مقايسة اللويحات هذه على أغار EHA الفاجات في مناطق تصفية يبلغ قطرها حوالي 1 mm. في غياب جسيمات الفاج المعدية، يؤدي النمو البكتيري إلى تعليق غائم من الخلايا في الأغار الرخو حيث لا تكون المستعمرات المنفصلة مرئية. في تقنية تغطية الأغار الرخو، تختلف مورفولوجيا اللويحات. على سبيل المثال، هنا تنتج نفس سلالة المضيف من mycobacterium مورفولوجيات لويحات متميزة في وجود مدمرات فاج microbacteria مقابل mycobacteria phage MSSS. تكمن قوة الزرع المتكرر في المسح المتزامن لعدد كبير من الكائنات الدقيقة. في هذه الحالة، تم اختبار أربع سلالات من pseudomonas بشكل مكرر للنمو على ثلاثة مصادر كربون مختلفة: acetamide وlactose وglycine. هنا، الطبق الأولي هو وسط YTA كامل تم تلقيحه بالسلالات الأربع كما هو موضح. تظهر السلالات أنماط نمو متغيرة على أطباق متكررة من وسط MSA الأدنى المكمل بمصدر كربون واحد وهو acetamide أو lactose أو glycine. تنمو جميع السلالات على طبق الضابط الإيجابي الأخير، مما يؤكد نقل الخلايا إلى جميع الأطباق الثانوية في هذه السلسلة. يوضح جدولة نتائج هذه الأطباق المتكررة المسح المتزامن للسلالات البرية المختلفة لمتطلبات النمو المميزة.

- بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنفيذ إجراءات الزرع دون تلويث الأوساط أو المزارع، وكذلك كيفية استخدام طريقة الزرع المناسبة لأي مهمة تجريبية محددة في المختبر. إن إتقان هذه التقنيات يتطلب الممارسة، ولكن مع التدريب المناسب، ستصبح إجراءات الزرع الموضحة في هذا الفيديو طبيعة ثانية عند العمل على طاولة المختبر.