تحليل كثرة الخلايا الزعترية المبرمج بواسطة البلاعم البريتونية

كثرة الخلايا البلعمية هي العملية التي تقوم بها الخلايا البلعمية بإزالة الخلايا المبرمجة.

لتحليل كثرة الخلايا ، احصل على الخلايا الزعترية الفأرية المبرمجة. احتضان مع صبغة CFSE نفاذية للخلية.

تشق الإسترازات داخل الخلايا CFSE إلى صبغة فلورية غير منفذة للخلايا ، مما يؤدي إلى تلطيخ الخلايا الزعترية. أضف السيروم المعطل بالحرارة لمنع البقع الزائدة.

ضع الخلايا الزعترية الملطخة على طبق ثقافة. أضف ستاوروسبورين ، وهو مثبط لبروتين كيناز ، والذي يعطل سلسلة الإشارات الخلوية الحرجة ، مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج. علاوة على ذلك ، تنتقل بقايا الفوسفاتيديل سيرين إلى النشرة الخارجية لغشاء الخلية ، وتعمل ك "إشارات أكلني".

أضف تركيزات الخلايا الزعترية المبرمج المتزايدة إلى آبار الصفائح متعددة الآبار التي تحتوي على البلاعم البريتونية المنشطة للفأر ، والتي تعبر عن مستقبلات معينة من التيروزين كيناز.

تربط هذه الكينازات الفوسفاتيديل سيرين المكشوف بالخلايا الزعترية المبرمج ، مما يسهل استيعابها بواسطة الضامة.

بعد الحضانة ، قم بإزالة الخلايا الزعترية المبرمجة العائمة بحرية. أضف الأجسام المضادة ل CD11b الموسومة بالفلوروفور ، والتي ترتبط بجزيئات CD11b من البلاعم.

باستخدام المجهر الفلوري ، لاحظ الخلايا الزعترية المبرمجة الفلورية داخل البلاعم الفلورية المختلفة ، مما يشير إلى كثرة التجوي.

الآبار ذات التركيزات العالية من الخلايا الزعترية المبرمجة زيادة في الخلايا الزعترية الداخلية.

لحصاد الخلايا الصعترية بعد فتح تجويف الصدر للفأر الساذج C57 / Black-6 ، استخدم ملقطا منحنيا ذو طرف رفيع لسحب الغدة الصعترية. ضع العضو في طبق زراعة الأنسجة يحتوي على 10 مل من وسط RPMI-1640. قم بطحن الغدة الصعترية بالكامل على الأطراف المتجمدة لشرائح مجهرية 2 ، وقم بتصفية تعليق الأنسجة الناتج من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب سعة 50 مل. اجمع الخلايا الزعترية عن طريق الطرد المركزي ، وأعد تعليق الحبيبات في 40 ملليلترا.

بعد العد ، قم بالطرد المركزي للخلايا مرة أخرى ، وأعد تعليق ما يصل إلى 2 × 10⁸ خلايا في 20 مل من PBS الطازج لكل أنبوب سعة 50 ملليلترا. قم بتسمية الخلايا ب 5 ميكرومولار CFSE في 20 مل من PBS لكل أنبوب. اقلب الأنابيب مرتين إلى ثلاث مرات للخلط ، قبل احتضان الخلايا الزعترية لمدة لا تزيد عن دقيقتين في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء. في نهاية الحضانة ، أوقف التفاعل باستخدام 10 ملليلتر من مصل الحصان المعطل بالحرارة ، واجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

أعد تعليق الخلايا المصنفة في 40 مل من PBS الطازج للعد والطرد المركزي ، متبوعا بغسل إضافي ب 40 مل من المتوسط. بعد الغسيل المتوسط ، أعد تعليق الخلايا الزعترية عند 7 × 10⁶ خلايا لكل مليلتر من تركيز وسط زراعة الأنسجة ، وزرع الخلايا في طبق زراعة الأنسجة 100 ملم. بعد ذلك ، أضف الستاروسبورين إلى مزرعة الخلايا بتركيز نهائي 1 ميكرومولار ، وضع اللوحة في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 4 ساعات.

لعزل البلاعم البريتوني ، قم بحقن فأرين C57 / Black-6 داخل الصفاق مع 1 مليلتر من 3٪ من الثيوغليكولات العمرية في اليوم 0 ، قبل فتح جلد البطن دون إزعاج الصفاق في اليوم 5.

لتنظيف التجويف البريتوني ، استخدم حقنة سعة 10 مليلتر مزودة بإبرة قياس 18 لدفع 10 ملليلتر من عازلة الغسيل بسرعة إلى التجويف قبل شفط عازلة الغسيل ببطء لتجميعها في أنبوب سعة 50 ملليلترا. اغسل التزقيم البريتوني مرتين باستخدام PBS. إعادة تعليق البلاعم البريتونية عند 2 في 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر من تركيز وسط زراعة الأنسجة.

بعد ذلك ، قم بزرع 500 ميكرولتر من البلاعم في كل بئر من صفيحة 24 بئرا ، وضع اللوحة في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة ساعتين. في نهاية الحضانة ، قم بشفط المادة الطافية لإزالة الخلايا العائمة ، وأضف 500 ميكرولتر من وسط زراعة الأنسجة إلى كل بئر.

أضف على الفور 0 إلى 12 × 10⁶ خلايا الغدة الصعترية في 500 ميكرولتر من الوسط إلى كل بئر من الثقافة ، وضع اللوحة في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 4 ساعات. في نهاية الحضانة ، اغسل كل بئر مرتين باستخدام PBS طازج لإزالة أي خلايا موت مبرمج عائمة بحرية ، متبوعا بغسل واحد مع مخزن تلطيخ. بعد ذلك ، قم بتسمية البلاعم المرتبطة باللوحة ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلوين مكملا بجسم مضاد مناسب مضاد ل CD11b لكل بئر ، وضع اللوحة عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.