استخدام اعتراض البصرية لدراسة التفاعلات المرضي المضيف الحيوي للخلية الحية التصوير

الهدف العام من التجربة التالية هو استخدام الاحتجاز البصري مقترناً بالمجهر البؤري ذو القرص الدوار لمراقبة التفاعلات بين المضيف ومسببات الأمراض في الوقت الفعلي. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إضافة مسببات الأمراض المستهدفة إلى غطاء زجاجي ذو حجرة، ثم اختيار جسيم واحتجازه باستخدام المصيدة البصرية.

وأخيرًا، يتم توجيه الجسيم إلى الخلية المستهدفة، كما هو موضح هنا. يمكن أن يكون الاحتجاز البصري طريقة فعالة للتحكم في جسيمين لمراقبة التفاعلات الديناميكية داخل الخلايا.

يمكن لهذه الطريقة الإجابة على أسئلة مهمة حول التفاعلات بين المضيف ومسببات الأمراض في مجالات الأمراض المعدية وعلم المناعة، بما في ذلك ما هو تأثير التحكم الكامل في العلاقات المكانية بين خلايا المضيف ومسببات الأمراض على عملية البلعمة، بالإضافة إلى ما إذا كان ترتيب ابتلاع مسببات الأمراض بواسطة خلية بلعمية يؤثر على نضج الجسيم البلعمي. وبشكل عام، قد يواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأن ظروف الاحتجاز يجب تحسينها لتناسب الأنواع المختلفة من الخلايا والخرزات. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية نظراً لعملية إعداد ودمج القرص الدوار.

يصعب تصور الربط بين المجهر البؤري والمصيدة الضوئية نظراً للمحاذاة الدقيقة الضرورية لجميع المكونات البصرية. قم بجمع الممرض المراد دراسته. على سبيل المثال، هنا، يتم سحب 300 µL من فطر Candida albicans الذي تمت زراعته طوال الليل في مرق مغذي من المزرعة، ثم تُنقل الممرضات إلى أنبوب تفاعل سعة 1.5 mL.

بعد ذلك، اغسل المسببات المرضية ثلاث مرات عند قوة طرد مركزية تبلغ 1300 Gs تقريبًا لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، مع سحب السائل العلوي وترك الراسب دون تحريك في كل مرة مع إعادة التعليق في PBS واستخدام الموجات فوق الصوتية. بعد الغسلة الثالثة، أعد تعليق الراسب في 500 microliters من PBS. بعد ذلك، أذِب واحد milligram من صبغة entrust في 100 microliters من dimethylformamide للوصول إلى تركيز نهائي قدره 10 milligrams per milliliter.

ثم أضف 3 µL من خليط الصبغة إلى أنبوب التفاعل الذي يحتوي على الممرضات المغسولة. ضع ورق رقائق الألومنيوم حول الأنابيب لأن الصبغات حساسة للضوء، ورج العينة عند 37 °C لمدة ساعة واحدة، ثم قم بترسيب العينة وغسلها في PBS ثلاث مرات كما سبق. أعد تعليق الراسب في 300 µL من PBS بعد الغسلة الأخيرة.

قم بتدفئة الوسط الذي يحتوي على التربسين وPVS إلى 37 °C في حمام مائي. اغسل طبق زراعة أنسجة مقاس 10 سم مغطى بخلايا RAW 264.7 البلعمية مرتين باستخدام PBS، مع شفط الـ PBS بين كل غسلة. بعد ذلك، غطِّ سطح الطبق بـ 5 mL من التربسين واحضن الطبق لمدة 5 دقائق عند 37 °C.

بعد ذلك، اطرق جانب الطبق بلطف لفصل الخلايا عن سطح الطبق، مع الحرص على عدم تطاير التريبسين خارج الطبق. الآن، أضف 5 mL من الوسط الغذائي إلى الطبق وانقل الخليط إلى أنبوب تفاعل.

بعد عملية الترسيب، يتم سحب الوسط الغذائي مع الحرص على عدم تعكير الراسب، ثم يُعاد تعليق الراسب في 10 milliliters من الوسط الغذائي. أضف 400 microliters من الوسط الغذائي إلى كل غرفة في شريحة الغرف، ثم أضف خمس microliters من معلق الخلايا إلى كل غرفة. تُترك الخلايا لتنمو طوال الليل في حاضنة عند 37 degrees Celsius مع 5%CO2.

أخرج شريحة الغرفة من الحاضنة، ثم انقل باستخدام الماصة من 5 إلى 10 µL من الممرضات المحددة الموَّسمة فلوريًا والمجهزة مسبقًا إلى كل غرفة تحتوي على البلاعم. امزج البلاعم والممرضات جيدًا عن طريق السحب والدفع بالماصة، مع الحرص على عدم لمس قاع الغرفة لتجنب تعريض البلاعم الملتصقة للاضطراب. قم بتشغيل جميع مكونات المجهر البؤري ذي القرص الدوار.

قم بتجهيز المجهر عن طريق إضافة الزيت إلى عدسة الشيئية الغمسية الزيتية. أدخل الشريحة ذات الغرفة في المنصة المخصصة، ثم قم بإزالة الجزء العلوي من الشريحة وقم بمحاذاة المجهر للتصوير بتباين التداخل التفاضلي (DIC). قم بتشغيل الغالق الخاص بالمصيدة البصرية وليزر الأشعة تحت الحمراء (IR laser).

افتح بعد ذلك غالق الليزر المؤدي إلى المصيدة البصرية. تأكد من أن الغالق الموجود أمام ليزر IR مغلق عن طريق الفحص باستخدام بطاقة IR. الآن، قم بتركيز العدسة على الخلايا البلعمية الموجودة على الشريحة الملتصقة.

بعد ذلك، ابحث عن المسببات المرضية العائمة بحرية في المحلول المجاور للخلايا البلعمية. ويتمثل الجزء الأكثر صعوبة في هذا الإجراء في العثور على الجسم المناسب لتتبعه في حجرة العينة بسبب قوى الالتصاق بين الجسم والزجاج الغطائي في حجرة العينة. ومن أجل تحريك ذلك الجسم، يجب تحريك المنصة بينما يتم تثبيت الجسم بواسطة ليزر التوجيه، ومن المهم أيضاً ملاحظة أنه يجب تحريك المنصة بسرعة بطيئة بما يكفي لضمان عدم تجاوز قوة السحب للمنصة لقوة الاحتجاز القصوى للمصيدة.

حرك المنصة بحيث يكون الممرض بالقرب من المصيدة. ثم افتح الغالق وقم بتفعيل المصيدة. حرك العينة لجعل الخلايا البلعمية تلامس صورة ممرض محاصر وثابت.

تَمَّ تصوير المسببات المرضية باستخدام مجهر بؤري ذو قرص دوار، سواءً عبر تباين التداخل التفاضلي (DIC) أو الفلورية أو مزيج منهما، حيث تم وسم مجموعات منفصلة من فطر *Candida albicans*، التي يبلغ حجمها عادةً حوالي 5 microns، باللون الأخضر والأزرق والأحمر. ولتوضيح عملية التصوير، تَمَّ اصطياد خلية واحدة من *C. albicans* وتحريكها في نمط مربع عبر تكتل من الخمائر الأخرى كما تشير الأسهم الرمادية، مما يبرهن على القدرة على التقاط والتحكم في الموقع المحدد لمسبب مرضي واحد يختاره المشغل حتى في البيئات المزدحمة. ولتوضيح مرونة هذا النظام في اصطياد الأشكال المورفولوجية المختلفة التي تظهرها الكائنات الممرضة في هذا الشكل، استُخدم الملقط الضوئي لإمساك ووضع جسيم من *C. albicans* يحتوي على خيط فطرى كاذب (pseudo hypha).

تم وسم *C. albicans* بصبغة حمراء، وتحركت على طول مسار محدد بسهم أبيض ووُضعت بجانب خلايا C3 الخام التي تعبر عن GFPL الفلورية، الموضحة باللون الأخضر. وقد حوصر الجزء الخميري من *C. albicans* بينما كانت الخيوط الفطرية الكاذبة تتبع المسار.

تم وضع Aspergillus fum أيضاً بجانب خلية بلعمية خام من فأر من أجل تحليل الإطار الزمني المطلق لعملية البلعمة مع هذا الخط الخلوي والممرض تحديداً. وفي هذا الشكل، تُظهر صور الحقل المضيء كيف تم نقل فطر Aspergillus المحتجز، كما يشير السهم الأبيض، ووضعه على طول المسار الموضح بالسهم الأحمر. ويبدو الممرض المحتجز خارج نطاق التركيز قليلاً بسبب قيام المصيدة بدفع الكائن الحي إلى الأعلى قليلاً فوق المستوى البؤري.

تم تحريك فطر Aspergillus حتى وُضع بجوار الخلية الخام المطلوبة. وبمجرد ملامسة الممرض للخلية، تم إيقاف تشغيل المصيدة. بعد ذلك، تم تفعيل عملية البلعمة واستُخدم التصوير بفاصل زمني لمراقبة الأحداث الخلوية اللاحقة.

عند الثانية 30، بدأ غشاء الخلية الخام في التغير وتشكيل كوب حول الجسيم. وعند الثانية 60، اكتمل تشكل الكوب. ومن الثانية 90 إلى الثانية 150، بدأ Afu Gotti في الابتلاع، وبحلول الثانية 180، تم استيعاب الجسيم داخلياً بشكل كامل.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء جهاز مصيدة بصرية ذات قرص دوار، وكيف يمكن لمثل هذه الأداة أن تمكن الشخص من التحكم في المسببات المرضية بطريقة غير جراحية من أجل تصوير الخلايا الحية بعد تطويرها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التفاعلات بين المضيف والمسببات المرضية لاستقصاء دور العلاقات المكانية بين خلايا المضيف والمسببات المرضية، ودورها في الاستجابة المناعية الناتجة.