استخدام نموذج لوصف EpiAirway طويل الأجل المضيف الممرض التفاعلات

الهدف العام من التجربة التالية هو إجراء زراعة مشتركة طويلة الأمد لبكتيريا نون-تايبابل هيموفيلوس إنفلونزا (Nontypeable Hemophilus influenza) أو NTHI مع أنسجة ظهارية تنفسية بشرية أولية باستخدام نموذج المجاري التنفسية الظهاري (epi airway model). ويتم تحقيق ذلك عن طريق تلقيح السطح القمي ببكتيريا NTHI للسماح للبكتيريا بالالتصاق بالأنسجة ودخولها كخطوة ثانية. يتم غسل الغرسات كل 24 ساعة باستخدام DPBS دافئ مسبقاً لمحاكاة التدفق الطبيعي للمخاط وإزالة نواتج فضلات الميوسين وأي حطام خلوي.

بعد ذلك، يتم حصاد الأنسجة في النقطة الزمنية المطلوبة وتحديد بقاء بكتيريا NTHI، سواء المرتبطة بالخلايا الكلية أو التي تم استيعابها داخلياً. وأخيراً، يمكن من خلال هذه الطريقة تقييم الخصائص النوعية للسلالة فيما يتعلق ببقاء NTHI داخل الأنسجة بمرور الوقت بناءً على تعدادات البكتيريا الحية. ورغم ذلك، يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤية متعمقة حول العدوى طويلة الأمد بـ nontypeable hemophilus influenza.

يمكن استخدامه أيضاً في دراسة مسببات الأمراض البشرية الأخرى مثل Moraxella Alis؛ وقد قام الدكتور Doin، وهو زميل ما بعد الدكتوراه في مختبري، بتوضيح هذا الإجراء. قم بإخراج طبق النقل من عبوته واستعد لبدء التجربة. رش طبق النقل بـ 70%ethanol وضع الطبق في كابينة السلامة الحيوية.

قم بتوزيع 1 mL من وسط صيانة epi airways المبرد عند 4 °C في كل بئر من أطباق الزرع ذات الستة آبار. بعد ذلك، قم بإزالة الشريط اللاصق، وافتح الطبق ثم أزل الشاش الذي يغطي إدراجات epi airway. وباستخدام حركة التدوير، استخدم ملقطاً لتحرير الإدراج من الـ aros.

ضع القطعة المُدرجة في أحد آبار الصفيحة ذات الستة آبار. إذا لزم الأمر، استخدم مسحة قطنية معقمة لإزالة الحلقات من القطعة المُدرجة بعناية، مع تجنب لمس الغشاء. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء محبوسة أسفل القطع المُدرجة.

وبعد ذلك، ضع الصفيحة ذات الستة آبار في الحاضنة. اغسل الغرسات يوميًا وفقًا لما يلي: قم بتدفئة محلول DPBS المضاف إليه الكالسيوم والمغنيسيوم مسبقًا، ثم املأ طرف الماصة بمحلول DPBS. بعد ذلك، وباستخدام ملقط معقم، ارفع الغرسة بلطف ثم انقل 200 µL من محلول DPBS الدافئ فوق النسيج.

بعد ذلك، قم بهز الحاشية لتوزيع DPBS بالتساوي دون لمس النسيج. ثم أمل الحاشية بزاوية معينة وضع طرف ماصة P 1000 مقابل الحلقة البلاستيكية التي تثبت الغشاء في قاع الحاشية. بعد ذلك، قم بشفط المحلول المنظم بعناية وضعه في أنبوب تجميد (cryo tube) لدراسته لاحقاً.

أخيرًا، قم بشفط وسط الصيانة القاعدي واستبدله بـ 1 milliliter من الوسط الطازج. قم بتدفئة مسبقة لمزيد من DPBS المحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم. أضف 3 milliliters من DPBS المدفأ مسبقًا إلى أنبوب سعة 15 milliliter، ثم قم بإعادة تعليق مستعمرات مفردة من nontypeable influenza أو NTHI التي نمت طوال الليل على أغار الشوكولاتة داخل الأنبوب.

الآن قم برج الأنبوب بقوة باستخدام جهاز الرج (vortex) لمدة 10 ثوانٍ على الأقل، ثم قم بقياس الكثافة الضوئية. استمر في إضافة مستعمرات منفردة من NTHI حتى يصل التركيز البكتيري إلى قيمة OD 600 nanometers تبلغ 0.7 تقريباً. بعد ذلك، اغسل كل شريحة إدخال للمجاري التنفسية EPI باستخدام DPBS مسبق التدفئة كما فعلت سابقاً، ثم أضف 28 microliters من المعلق البكتيري إلى السطح القمي لكل شريحة إدخال.

تجنب تلقيح أوساط الصيانة الأساسية. بعد ذلك، أعد الطبق إلى الحاضنة لتقدير كمية NTHI، مع القيام بتسخين مسبق لـ أغار الشوكولاتة مسبقاً ثم تجفيف السطح. بعد ذلك، قم بإجراء تخفيف تسلسلي للقاح NTHI باستخدام PBS معقم يحتوي على 0.1% gelatin أو PBSG.

ضع مقادير مقدارها 10 µL من اللقاح على الأطباق، ثم قم بتحضين الأطباق طوال الليل عند 37 °C في 5% carbon dioxide. وفي اليوم التالي، حدد عدد CFUs لكل ملليلتر عن طريق عد التخفيف الذي يحتوي على 15 إلى 30 مستعمرة متميزة في كل قطرة، ثم احسب القيمة العكسية للكمية الفعلية من لقاح NTHI القابل للحياة لجمع إجمالي البكتيريا المرتبطة بالخلايا. اشطف السطح القمي للمجاري التنفسية الظهارية ثلاث مرات باستخدام 200 µL من DPBS الخالي من الكالسيوم أو المغنيسيوم.

بعد ذلك، قم بإمالة الغشاء الداخلي واشطف أي بقايا من وسط الصيانة من الغشاء القاعدي. ضع الغشاء الداخلي المغسول في طبق سداسي الفجوات جديد وأضف 250 µL من محلول saponin المعقم بتركيز 1% على السطح القمي لكل نسيج. أعد الطبق إلى الحاضنة لمدة 10 دقائق أثناء فترة التحضين.

قم بتجهيز أنابيب التخفيف المتسلسل بملء كل أنبوب تخفيف بـ 900 µL من PBSG. بعد ذلك، قم بكشط النسيج من الغشاء باستخدام طرف ماصة P 1000 عبر تحريكها ذهاباً وإياباً، متبوعاً بحركة دائرية لإزالة النسيج من حواف الإدراج. ثم باستخدام طرف ماصة P 1000 معقم ذو فتحة واسعة، ضع المعلق في أنبوب einor فارغ سعة 1.5 mL.

أضف الآن 250 µL من DPBS على السطح القمي للمدرج، ثم افحص المدرج باستخدام مجهر تباين طور مقلوب لتحديد ما إذا كان هناك أي نسيج متبقٍ للحصاد. أضف المعلق إلى أنبوب einor وأكمل الحجم بـ 500 µL من DPBS بقوة. قم برج معلق الخلايا باستخدام جهاز Vortex لمدة دقيقة واحدة.

بعد ذلك، وباستخدام محقنة معقمة سعة 1 mL مزودة بإبرة قياس 26 gauge، يتم سحب المعلق إلى داخل المحقنة عبر الإبرة. مرر المعلق ببطء عبر الإبرة ثلاث مرات، مع الحرص على عدم تكوين فقاعات.

بعد ذلك، قم برج المعلق بقوة باستخدام جهاز الرج (vortex) لمدة دقيقة أخرى. ثم، استخدم رأس ماصة بفتحة واسعة لنقل 100 µL من المعلق إلى أنبوب التخفيف الأول. رج الأنبوب بقوة لمدة خمس ثوانٍ، ثم قم بإجراء تخفيف تسلسلي من 1 إلى 10، ووزع نقاطاً من التخفيف على أطباق آجار الشوكولاتة.

بعد ذلك، يتم تحضين الأطباق طوال الليل عند 37 درجة مئوية في 5% carbon dioxide لحساب عدد البكتيريا القابلة للحياة بهدف حصاد البكتيريا التي تم استيعابها داخلياً. يتم غسل كل insert ثلاث مرات فقط باستخدام 200 µL من DPBS. استبدل وسط الصيانة القاعدي بوسط يحتوي على 100 µg/mL من gentamycin sulfate، ثم أضف 300 µL من وسط الصيانة المحتوي على Gentamycin على السطح القمي.

أعد الغرسات إلى الحاضنة لمدة ساعة واحدة، وأثناء فترة تحضين الغرسات، قم بتدفئة مسبقة لـ DPBS. بعد ذلك، قم بإزالة وسط الصيانة المحتوي على Gentamycin من السطح القمي. ثم اغسل السطح القمي والغشاء القاعدي للغرسات جيداً باستخدام DPBS المُدفأ مسبقاً.

أخيرًا، كرر إجراء الفرك والحصاد الذي تم توضيحه للتو قبل إجراء التخفيفات المتسلسلة وزراعة البكتيريا التي تم استيعابها داخلياً كما هو موضح في هذا الشكل. وبمقارنة صور المجهر الإلكتروني الماسح لأنسجة الممرات الهوائية الطلائية غير المصابة على اليسار مع أنسجة الممرات الهوائية الطلائية المصابة بـ NTHI لمدة خمسة أيام على اليمين، يمكن ملاحظة أن الزراعة المشتركة طويلة الأمد مع NTHI لا تؤدي إلى تلف كبير في الأنسجة القمية، مما يؤكد فائدة نموذج الممرات الهوائية الطلائية.

يظهر هنا رسم بياني يوضح عدد بكتيريا NTHI التي تم استيعابها داخلياً بمرور الوقت خلال استزراع مشترك للمسالك الهوائية الظهارية. تم تلقيح السلالة R 2 8 6 6 بتركيز تقريبي قدره one times 10 of the seventh CFU لكل قطعة غرس. بعد ذلك، تم حصاد البكتيريا المستوعبة داخلياً وتعدادها عند كل نقطة زمنية محددة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء الزراعة المشتركة طويلة الأمد لبكتيريا NTHI مع الأنسجة التنفسية الهرمونية الأولية باستخدام نموذج A PRE.