التنميط الجهد بوابات مرنا قناة البوتاسيوم التعبير في الخلايا العصبية Nigral باستخدام خلية واحدة RT - PCR تقنيات

الهدف العام من هذا الإجراء هو الكشف عن الحمض النووي الريبوزي المرسال (messenger RNAs) في العصبونات الفردية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تثبيت الرقعة (patch clamping) وتسجيل العصبونات الفردية، ثم سحب السيتوبلازم بالكامل من كل عصبون تم تسجيله من Mr.mRNA والسيتوبلازم. بعد ذلك، يتم تحضير الـ CD NA وتضخيمه بواسطة تقنية PCR.

وفي النهاية، يمكن الكشف عن mRNAs محددة للمستقبلات والقنوات الأيونية والإنزيمات من خلال نظام تصوير الهلام التقليدي. اسمي هو، وأعمل في مركز العلوم الصحية بجامعة تينيسي. وبوجه عام، قد يواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة صعوبة لأن كمية mRNAs في عصبون واحد صغيرة للغاية ومن السهل فقدانها.

ابدأ هذا البروتوكول باستخدام جهاز التقطيع الاهتزازي (vibratome) لقطع شرائح دماغية إكليلية بسمك 300 micrometer تحتوي على الجزء الأمامي الأوسط من المادة السوداء. يمكن عزل الأدمغة من جرذان من سلالة sprague dawley تتراوح أعمارها بين 15 إلى 40 يوماً. تُجرى عملية تقطيع الشرائح في حالة تبريد شديد باستخدام محلول تقطيع عالي السكروز، مشبع بالأكسجين بنسبة 95% oxygen و 5% carbon dioxide، وبدرجة pH تبلغ 7.4، ثم تُحضن الشرائح في سائل نخاعي شوكي اصطناعي يتم تمرير غاز مكون من 5% carbon dioxide و 95% oxygen من خلاله.

حافظ على درجة الحرارة عند 34 °C واترك الشرائح هناك لمدة 45 دقيقة. بعد ذلك، احتفظ بشرائح الدماغ في درجة حرارة الغرفة حتى بدء التسجيل. ابدأ بنقل شريحة دماغ واحدة إلى غرفة تسجيل تثبيت الرقعة (patch clamp).

يتم التروية باستمرار باستخدام سائل دماغي شوكي اصطناعي مؤكسج عند درجة حرارة 32 °C. املأ ماصات الرقعة (patch pipettes) بمحلول داخل خلوي مُعقم بجهاز الأوتوكلاف ومُحضّر باستخدام مياه خالية من DNAs و RNAs. ثم أنزل الماصة المملوءة في الحمام.

تحقق من أن المقاومة تتراوح بين 2 و 3 mega ohms. أولاً، حدد موقع المادة السوداء (substantial nigra) من خلال موقعها التشريحي المميز. ثم باستخدام بصريات namar وعدسة شيئية بقوة 60 x، اختر خلايا كبيرة في SNC و SNR للتسجيل.

هذه عصبونات دوبامينية أو جاباوية (GABAergic) محتملة دون أدنى شك. استخدم تكوين الخلية الكاملة التقليدي بإحكام غيغاوات (giga tight seal) لإجراء تثبيت التيار (current clamp) وتثبيت الجهد (voltage clamp). يجب إجراء هذه التسجيلات عموماً في أقل من خمس دقائق لتقليل تحلل mRNA.

في غضون دقيقة تقريبًا، يمكن تقديم بصمات كهرومغناطيسية للعصبونات المستهدفة من خلال تسجيل خصائص غشائها ونبضاتها الكهربائية فقط. بعد الحصول على البيانات من العصبون المستهدف، استخدم شفطًا فمويًا لطيفًا لسحب السيتوبلازم. يجب عدم كسر الختم المحكم، وإلا فإن ذلك سيؤدي إلى فقدان الاتصال.

قد يتم سحب الحطام خارج الخلوي، بما في ذلك mRNA، إلى ماصة الرقعة (patch pipette) مما يؤدي إلى تلوث محتوى الخلية. قم بتفريغ محتوى الخلية في أنبوب PCR سعة 0.2 milliliter عن طريق كسر طرف الماصة وتطبيق ضغط إيجابي خفيف. عند الانتهاء، ضع الأنبوب فوراً في مجمد بدرجة حرارة 20- درجة مئوية لاستبعاد تلوث الحطام خارج الخلوي الذي قد يحتوي على mRNAs.

قم بإعداد ضابط سلبي عن طريق جمع محتويات ماصة رقعية (patch pipette) يتم إنزالها في النسيج دون إجراء أي عملية شفط. وبعد جمع محتويات الخلايا من 10 إلى 20 عصبوناً، ابدأ فوراً بتفاعل النسخ العكسي. ولتقليل تحلل جزيئات mRNAs، ابدأ بهضم أي DNA جينومي ملوث باستخدام DNase لمدة خمس دقائق عند 25 degrees Celsius.

تعتبر هذه الخطوة حاسمة في تقليل الإيجابيات الكاذبة المحتملة ولا ينبغي تجاوزها. بعد ذلك، قم بتثبيط الـ DNAs باستخدام 1.2 µL من 25 mM EDTA وحضن العينات عند 70 °C لمدة خمس دقائق. الآن، استخدم طقمًا متاحًا تجاريًا لتخليق CD NA للتحقق من إزالة الـ genomic DNA تمامًا.

أجرِ تفاعل ضابط لكل عينة بدون استخدام إنزيم النسخ العكسي (reverse transcriptase)، مع الإبقاء على جميع مكونات التفاعل الأخرى كما هي. احفظ النواتج عند درجة حرارة -20 °C حتى يحين وقت استخدامها في تصميم تفاعل PCR.

استخدم البادئات وفقاً للتسلسلات الموجودة في Gen bank، وحيثما أمكن، قم بإجراء إصلاحات للبادئات الممتدة عبر الإنترون (T intro spanning prime) للمساعدة في الكشف عن تلوث الحمض النووي الجينومي. وللتحقق من فعالية أزواج البادئات، اختبرها على cDNA للدماغ الكامل في المرحلة الأولى. قم بتضخيم 5 µL من الـ cDNAs التي يبلغ حجمها 30 µL بواسطة PCR لمدة 35 دورة باستخدام بروتوكول قياسي للدورات الحرارية.

في المرحلة الثانية، قم بتضخيم ميكرولتر واحد من ناتج PCR للمرحلة الأولى باستخدام نفس بادئات الإصلاح مع استخدام ملف دورات معدل قليلاً. الآن، قم بفصل النواتج على هلام AGROS بتركيز 2.5% وقم بتصويرها باستخدام بروميد AUM أو gel green. تحت الأشعة فوق البنفسجية، قم باستئصال حزم DNA الموجبة وتسلسلها باستخدام طقم متاح تجارياً لجمع الـ DNA.

تمت مقارنة الخصائص الفيزيولوجية الكهربائية للعصبونات في المادة السوداء، الجزء المدمج والجزء الشبكي. أظهرت العصبونات GABAergic في المادة السوداء نشاطاً تلقائياً بتردد أعلى، حيث بلغ حوالي 10 hertz. وكان للنبضات مدة أساسية تقارب one millisecond عند حقن تيار مفرط الاستقطاب.

أظهرت العصبونات GABAergic في المنطقة السوداء (SNR) استجابة SAG طفيفة تشير إلى وجود تيار مُنشط بشكل ضعيف. وفي المقابل، أظهرت العصبونات الدوبامينية في المادة السوداء نبضات تلقائية منخفضة التردد بمدة أساسية تبلغ حوالي ثلاثة مللي ثانية. كما أظهرت العصبونات الدوبامينية SAG واضحاً استجابةً لفرط الاستقطاب، مما يشير إلى تعبير قوي عن تيار IH في العصبونات GABAergic في SNR، ولكن ليس في العصبونات الدوبامينية.

كشف تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي للخلية الواحدة (Single cell R-T-P-C-R) عن وجود mRNA لإنزيم glutamic acid decarboxylase one، وهو إنزيم رئيسي في تصنيع GABA. وفي المقابل، كشف تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي للخلية الواحدة عن وجود mRNA لإنزيم tyrosine hydroxylase، وهو إنزيم رئيسي لتصنيع الدوبامين، في الخلايا العصبية الدوبامينية المحددة في SNC و SNR، ولكن ليس في الخلايا العصبية GABAergic.

بعد ذلك، استُخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي للخلية الواحدة (single cell R-T-P-C-R) لتحليل تعبير الوحدات الفرعية لقناة KV 3 المنشطة بالجهد، والتي تعمل على تغيير خصائص قنوات البوتاسيوم المبوبة بالجهد. في مثال SNR gaba، تم الكشف عن mRNAs العصبونية لكل من KV 3.1 و 3.2 و 3.3 و 3.4 في عصبون S-N-R-D-A نموذجي فقط. كما تم الكشف عن KV 3.2 و 3.3 و 3.4 في البيانات المجمعة.

تم اكتشاف KV 3.1 بشكل أكثر تكراراً في عصبونات SNR GABAergic مقارنة بالعصبونات الدوبامينية في المادة السوداء، مما يشير إلى مستوى تعبير أعلى لـ KV 3.1 في عصبونات SNR GABA السريعة. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر ارتداء القفازات والحفاظ على الأدوات خالية من الملوثات بعد استخدامها. لقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال العلوم العصبية لاستكشاف تعبير ووظيفة المستقبلات والقنوات الأيونية في الجهاز العصبي.