كمي من إندوسوم و ليسوسوم التحركات في الخلايا العصبية المستزرعة باستخدام تحقيقات الفلورسنت

الهدف العام من تحليل التصوير هذا هو مراقبة حركة الحويصلة في الخلايا العصبية وتحديدها بسهولة. يتيح هذا النهج للمرء تحليل الاتجار بالغشاء في الخلايا العصبية بطريقة مباشرة وفعالة من حيث الوقت. لبدء هذا الإجراء ، انقل الرحم إلى طبق بتري جديد يحتوي على 70٪ من الإيثانول.

بعد ذلك ، انقل الرحم إلى طبق بتري آخر مع HBSS. ثم قم بإزالة الأجنة من الرحم باستخدام ملقط تشريح معقم ومقص جراحي. بعد ذلك ضعهم في طبق بتري جديد مع HBSS.

تحت المجهر الاستريو ، قم بإزالة الجلد والجماجم وأخرج الأدمغة باستخدام ملقط التشريح المعقم. ثم انقلها إلى طبق بتري آخر مع HBSS. قم بإزالة السحايا باستخدام ملقط تشريح معقم.

ثم قم بقص المناطق الإضافية. بعد ذلك ، انقل القشرة إلى طبق بتري جديد مع HBSS. اجمع كل القشرة باستخدام قطارة يمكن التخلص منها أو ماصة سعة 25 مليلتر وضعها في أنبوب سعة 15 ملليلترا.

بعد ذلك ، قم بإزالة HBSS عن طريق سحب العينات. ثم أضف ثلاثة ملليلتر من محلول الإنزيم القشري الدماغي إلى الأنبوب الذي يحتوي على القشرية. ضع الأنبوب في حمام مائي واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك ، أضف ثلاثة ملليلتر أخرى من محلول الإنزيم القشري الدماغي في الأنبوب الذي يحتوي على القشرة واحتضانها عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة خمس دقائق إضافية. بعد خمس دقائق ، قم بإزالة محلول الإنزيم القشري الدماغي وأضف خمسة ملليلتر من DMEM الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري للجنين. افصل القشرة عن طريق سحب القشرة برفق لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة سعة خمسة ملليلتر بطرف معقم P1000.

ثم قم بتقطيع القشرة مرة أخرى باستخدام ماصة سعة خمسة ملليلتر بطرف P200. ضع مصفاة خلية نايلون 40 ميكرومتر على أنبوب سعة 50 مليلتر وقم بتصفية التعليق لإزالة الحطام. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للتعليق عند 420 مرة جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم قم بإزالة وسيط DMEM.

بعد ذلك ، أضف خمسة ملليلتر من وسط الثقافة القشرية الدماغية وأعد تعليق حبيبات الخلية برفق. ثم عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم واضبط تركيز الخلية باستخدام وسط الثقافة القشرية الدماغية. بعد ذلك ، قم بلوحة ثلاثة في 10 إلى الخلايا العصبية القشرية الستة في ملليلترين من تعليق الخلية لكل طبق سفلي زجاجي مشفر سعة 35 مل.

في هذا الإجراء ، امزج أربعة ميكروغرامات من البلازميد مع 200 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل. في أنبوب منفصل ، قم بتخفيف ثمانية ميكرولترات من كاشف التعدي في 200 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل. ثم احتضان المحلول لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد خمس دقائق ، اخلطي محلول البلازميد ومحلول كاشف النفدة واحتضان الخليط لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف الخليط إلى أطباق القاع الزجاجي المشفرة. احتضان الخلايا العصبية عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك ، استبدل الوسط بملليلترين من وسط الثقافة القشرية الدماغية واحتضان الخلايا العصبية عند 37 درجة مئوية لمدة يوم إلى يومين. للتصوير ، استخدم مجهر مضان مزود بكاميرا CCD مع عدسات موضوعية 40X. حافظ على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية باستخدام نظام الحضانة.

احصل على صور الخلايا العصبية في إطار واحد كل خمس ثوان خلال فترة 100 ثانية يتحكم فيها برنامج الحصول على الصور. لتحليل الصور ، افتح جميع الصور المتسلسلة في برنامج ImageJ باستخدام التتبع اليدوي. لدمج الصور المتسلسلة، اختر Image، ثم Stacks، متبوعا ب Images to Stack، ثم انقر فوق OK. بعد ذلك ، اختر الإضافات ثم التتبع اليدوي.

ستظهر نافذة تتبع. انقر فوق مربع الاختيار إظهار المعلمات وحدد معلمات التتبع في قسم المعلمات. ثم انقر على إضافة مسار لبدء مسار جديد.

بعد تحديد الحويصلات ذات الأهمية ، انقر فوق مركز الإشارات في الصور المتسلسلة لتسجيل إحداثيات xy. كرر هذا الإجراء لتجميع إحداثيات xy للحويصلات من جميع الصور المتسلسلة ، وتتقدم كل صورة تلقائيا إلى الصورة المتتالية بعد تحديد النقطة المرجعية. توضح هذه الصورة حركة LAMP-EGFP التي تحتوي على حويصلات في تشعبات الخلايا العصبية القشرية للفأر بعد يومين من التعدي ، بدأت في أربعة DIV.

يظهر الجزء الداخلي صورة الفاصل الزمني للحويصلات الموجبة LAMP-EGFP. يشير رأس السهم الأحمر إلى حويصلة متحركة ويشير رأس السهم الأزرق إلى حويصلة مستريحة. تشير رؤوس الأسهم البرتقالية إلى إشارات فلورية أعلى.

فيما يلي موضع المحور X المعتمد على الوقت للحويصلات الموجبة LAMP-EGFP. تتحرك الحويصلة الموجودة في الدائرة الحمراء ، المسماة b ، وتستريح الحويصلة الموجودة في الدائرة الزرقاء ، المسماة a. يشير هذا الرسم البياني الشريطي إلى المسافة الإجمالية لحركة LAMP-EGFP.

ويشير هذا الرسم البياني الشريطي إلى متوسط مسافة الحركة لمصباح LAMP-EGFP الذي يحتوي على حويصلات.