الخلية المستندة إلى الفحص الكالسيوم لمتوسطة إلى فحص وظائف إنتاجية عالية باستخدام قناة الحزب FlexStation 3

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح كيفية استخدام Flex Station three لدراسة الملف الدوائي لقناة المستقبل العابر المحتمل أو قناة TRPA1. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تحضير خلايا تعبر عن قنوات TRPA1 في أطباق معايرة دقيقة ذات 96 بئراً.

بعد غسل الخلايا في غسالة الأطباق الدقيقة، يتم تحميل الخلايا بالصبغة الفلورية الحساسة للكالسيوم. تلي فترة تحميل الخلايا عدة عمليات غسل إضافية. الخطوة التالية من الإجراء هي تحضير طبق المركبات، بما في ذلك ناهض trip 1 ومضاد trip 1 مفترض.

كخطوة نهائية، يتم ضبط معاملات البرنامج لقراءة الأطباق في نظام Flex Station three. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر علاقات الاستجابة للجرعة لتنشيط trip A one بواسطة flu phonemic acid، والتثبيط بواسطة المركب المضاد A. وعلى الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية حول آليات تنشيط 21 من خلال قياس تدفق الكالسيوم، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً لدراسة وظائف القنوات الأيونية الأخرى النفاذة للكالسيوم والمستقبلات المقترنة بالبروتين G باستخدام صبغات الفلورسنت الحساسة للكالسيوم أو صبغات الجهد الغشائي.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذا التكتيك مقارنة بالطرق الحالية مثل تصوير الكالسيوم ورسم الخرائط اليدوي للرقعة في أن هذه التقنية الموفرة للوقت توفر فحصاً عالي الإنتاجية لوظيفة وتعديل قنوات الكالسيوم وقنوات الحديد ومستقبلات تعبئة الكالسيوم الأخرى. قبل البدء في هذا البروتوكول، قم بتنمية خلايا HEC 2 93 التي تم نقل trip A one إليها بشكل مستقر بكثافة تتراوح من 70 إلى 90% كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. لبدء تحضير الخلايا لمقايسة الكالسيوم، قم بطلاء أطباق ذات 96 بئراً عن طريق نقل 50 µL من poly L ornithine إلى كل بئر، ثم حضن الأطباق عند 37 °C لمدة 15 دقيقة على الأقل.

بعد فترة التحضين، اشطف الخلايا مرة واحدة باستخدام المحلول الملحي الموقوت بالفوسفات الخاص بـ KO. بعد استخدام التريبسين، انقل الكمية المطلوبة من خلايا HEC 2 93 إلى أنبوب معقم بقاعدة مخروطية سعة 15 مليلتر وقم بطرد العينة مركزياً. تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق كتلة الخلايا الناتجة.

في وسط استزراع DMEM المكمل بـ 10% من مصل جنين البقر المثبط حرارياً، وزع 100 µL من معلق الخلايا في كل بئر من طبق الـ 96 بئراً. باستخدام ماصة متعددة القنوات، اترك الطبق في غطاء التدفق الصفحي لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل وضعه في حاضنة استزراع الخلايا المرطبة لمدة تتراوح بين 20 إلى 44 ساعة. لتحضير مقايسة الكالسيوم، قم أولاً بتحضير المحاليل كما هو موضح في البروتوكول المكتوب.

بمجرد التحضير، اخلط 10 µL من flu oh 4:00 AM بتركيز 1 mM مع 10 µL من onic. F1 27، ثم انقل المحتوى بالكامل إلى 5 mL من محلول flu. Oh four assay buffer المدعم بـ 0.1% bovine serum albumin.

بعد ذلك، اغسل الخلايا التي نمت في أطباق 96 بئراً باستخدام HBSS بمعدل 80 µL لكل بئر مرتين باستخدام غسالة الأطباق الدقيقة. بعد الغسل، أضف محلول تحميل fluo-4 بمعدل 50 µL لكل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات، ثم حضّن الطبق عند 37 °C لمدة ساعة واحدة. وخلال فترة تحميل الخلايا التي تستغرق ساعة واحدة، قم بتحضير سلسلة من محاليل agonists بتركيز 3x، وسلسلة من محاليل antagonist بتركيز 3x، وحجم كبير من agonist بتركيز 300 µM في محلول منظم fluo-4 assay.

أضف 300 µL من محاليل المركبات المخففة إلى طبق مركبات ذي 96 بئراً. رتّب التخفيف التسلسلي للمركب مع الضوابط الموجبة والسالبة المقابلة في نفس العمود من طبق المركبات كلما أمكن ذلك. ونظراً لأن محطة Flex station three تقرأ عموداً واحداً في كل مرة، فقم بنقل 300 µL من محلول المحفز بتركيز 300 µM إلى البئر المجاور لكل بئر يحتوي على المضاد كخطوة نهائية في تحضير الخلايا.

اغسل الخلايا المحملة ثلاث مرات باستخدام منظم حمض flu oh four باستخدام غسالة الأطباق الدقيقة بعد الغسلة الأخيرة. اترك 80 µL من منظم حمض flu oh four في كل بئر. لبدء قراءة الطبق، قم بتشغيل نظام Flex Station three وافتح برنامج soft max Pro 5.2.

احفظ التجربة باسم ملف جديد في إعدادات التجهيز. اختر الوضع المرن (flex mode) وأدخل المعاملات لقياس تأثير المحفز والمثبط كما هو موضح في الإجراء المكتوب. بعد ذلك، ضع صندوق رؤوس الماصات الجديد، ولوحة المركبات، ولوحة القراءة في الصواني المناسبة في المحطة المرنة. ثلاثة.

ابدأ قراءة الطبق بالنقر على زر القراءة (read) في برنامج Soft Max Pro. ستقوم محطة Flex Station three بقراءة عمود واحد في كل مرة وإضافة المركبات في النقاط الزمنية المبرمجة مسبقاً دون مقاطعة عملية القراءة. وبمجرد اكتمال التشغيل، يمكن معالجة البيانات التجريبية مباشرة باستخدام برنامج Soft Max PRO أو نسخها ولصقها في أي برنامج جداول بيانات مثل Microsoft Excel.

لتحليل البيانات، قم بإنشاء منحنيات الاستجابة للتركيز لكل من المادة المفعّلة fluphenamic acid، والمركب الذي يُفترض أنه مضاد، وذلك باستخدام ملاءمة المربعات الصغرى كما هو موضح في الإجراء المكتوب. إن TRPA1 عبارة عن قناة كاتيونية نفاذة للكالسيوم، يؤدي تنشيطها إلى تدفق الكالسيوم الذي يمكن اكتشافه بواسطة صبغة Fluo-4 AM الحساسة للكالسيوم. تظهر آثار تمثيلية للمسارات الزمنية لتغيرات الفلورة استجابةً لسلسلة من تركيزات fluphenamic acid أو FFA عند التركيزات العالية. تثير FFA زيادات في الفلورة بحركية أسرع بكثير مما هي عليه عند التركيزات المنخفضة، على الرغم من تقارب مستويات ذروة الفلورة.

للتمييز بين هذه الاختلافات، تم إنشاء علاقة الاستجابة للتركيز عن طريق قياس المعدلات الأولية لزيادة الفلورية. وعند إضافة تركيزات متفاوتة من FFA، تم تحديد التركيز الفعال النصفي الأقصى لـ FFA ليكون 55.4 micromolar. كما يظهر في الشكل علاقة الاستجابة للتركيز لتثبيط استجابة الكالسيوم التي يحفزها FFA بواسطة مركب A، وهو مضاد مفترض لـ trip a one.

قللت الجرعة بشكل مستقل من استجابة خلايا trip A one لـ FFA بتركيز مثبط نصفي أقصى قدره 4.3 micromolar. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية دراسة السمات الفارماكولوجية لـ triple A one والقنوات ذات الصلة باستخدام flag station three.