حفز الكميات وتحليل تشكيل HO - نوكلياز داخلية Translocations الصبغية التي ستراند ، واحدة في التخمير السكيراء الجعوية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد التحكم الجيني في تكوين الانتقال الصبغي عن طريق الالتواء أحادي السلسلة في خلايا خميرة التبرعم ثنائية الصيغة الصبغية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تلقيح المزارع بمستعمرات مفردة ذات نمط جيني محدد وتنميتها طوال الليل. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تحفيز تكوين كسر مزدوج السلسلة متزامن بواسطة إنزيم القطع الداخلي ho على كروموسومين من خلال إضافة الجالاكتوز إلى المزارع.

يتم استزراع التخفيفات التالية من هذه المزارع على أوساط اختيارية وأوساط غير اختيارية. وتتمثل الخطوة النهائية في تحديد تردد الانتقال عن طريق عد المستعمرات الناتجة على الأوساط الاختيارية وغير الاختيارية. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر التحكم الجيني في تكوين الانتقال بواسطة شريط مفرد، وذلك من خلال التغيرات في تردد تكوين الانتقال المحفز في سلالات ذات أنماط جينية مختلفة.

تمتد تداعيات هذه التقنية لتشمل عواقب التعرض للإشعاع العلاجي لمرضى السرطان، لأن تكسر شريط DNA المزدوج وتكون الانتقالات الكروموسومية هما النتيجتان الأساسيتان لهذا العلاج. لبدء إجراء تحديد ترددات انتقال ho المحفزة، يتم تلقيح من 10 إلى 20 مزرعة مستقلة بحجم 1 mL من وسط Y peak glycerol lactate بمستعمرات مفردة من النمط الجيني المطلوب، وتُحضن المزارع طوال الليل عند 30 °C على جهاز تدوير. وعندما تصل المزارع إلى كثافة الخلايا المطلوبة، أضف 20% galactose إلى المزارع ليصل التركيز النهائي إلى 2%. سيعمل galactose على تحفيز تعبير endonuclease ho، والذي سيوجه تكسير الشريط المزدوج عند أليل history delta five prim على الكروموسوم 3 وأليل has three delta three prim على الكروموسوم 15؛ ثم تُحضن المزارع لمدة أربع ساعات عند 30 °C على جهاز تدوير.

تعد الخطوة التالية حاسمة لنجاح الإجراء؛ لذا فإن التخفيف الدقيق للمزارع وزرعها أمر ضروري. لضمان الحصول على ترددات انتقال قابلة للتكرار بشكل كافٍ للسماح بإجراء مقارنات ذات دلالة إحصائية بين السلالات ذات الأنماط الجينية المختلفة، يتم بعد مرور أربع ساعات زرع تخفيفات مناسبة من المزارع على وسط يفتقر إلى الـ histidine وكذلك على وسط YPD بحيث يكون عدد المستعمرات من 100 إلى 200 مستعمرة تقريبًا لكل طبق، ثم تُحضن الأطباق عند درجة حرارة 30 degrees Celsius لمدة تتراوح من يومين إلى ثلاثة أيام.

عند ظهور المستعمرات، يمكن تحديد تردد الانتقال الصبغي. ستشير كفاءات الطبق قبل وبعد تحفيز تعبير إنزيم القطع الداخلي ho إلى ما إذا كان وجود أو غياب أي من كروموسومي الانتقال يؤثر على القدرة على البقاء بعد تكوين كسور مزدوجة السلاسل (DSB). يتم تكسير نسخة واحدة من كل من الكروموسوم 3 والكروموسوم 15 لتحديد كفاءات الطبق قبل التحفيز.

أولاً، يتم سحب عينة من الخلايا من كل مزرعة نمت طوال الليل وتحديد عدد الخلايا عن طريق العد باستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometer). بعد ذلك، يتم استخدام تخفيف مناسب لزراعة ما يقرب من 100 إلى 200 خلية على وسط YPD، ثم تُحضن لمدة يومين إلى ثلاثة أيام عند 30 °C حتى تظهر المستعمرات. يُضاف جالاكتوز بتركيز 20% إلى المزارع المتبقية ليصل التركيز النهائي إلى 2%، وتُحضن عند 30 °C لمدة أربع ساعات لتحديد كفاءة الزراعة بعد الحث.

قم بإزالة جزء من الخلايا من كل مزرعة بعد أربع ساعات من الحث، وحدد عدد الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometer). قم بزارعة ما يقرب من 100 إلى 200 خلية باستخدام تخفيف مناسب على وسط YPD، ثم حضنها لمدة يومين إلى ثلاثة أيام عند 30 درجة Celsius حتى تظهر المستعمرات. وبمجرد ظهور المستعمرات على الأطباق، يمكن تحديد كفاءة الزرع. كما يمكن فحص المستنسخات التي يُحتمل أنها تحمل انتقالاً كروموسومياً باستخدام تقنية Southern blot.

تستخدم هذه العملية DNA جينومي تم تحضيره من مستعمرة إعادة تركيب واحدة من كل تجربة مستقلة. يتم هضم ما يقرب من 4 µg من كل عينة DNA باستخدام إنزيم القطع BAM H one، ثم تُفصل القطع المهضومة بواسطة BAM H one على هلام agarose بتركيز 0.7%، وبعد ذلك تُنقل إلى غشاء نايلون موجب الشحنة يتم تهجينه بواسطة مسبار مُعلم بـ P 32 تم الحصول عليه عن طريق التأسيس العشوائي باستخدام استنساخ جينومي بمقدار 1.8 kb من BAM H one يحتوي على جين HIS three. يتم تصور قطع DNA عن طريق التصوير الشعاعي الذاتي أو التصوير الفسفوري. وهناك طريقة أخرى لفحص المستعمرات التي يُفترض أنها تحمل انتقالاً صبغياً وهي تحليل مخطط الكروموسومات.

يتم تحضير الكروموسومات أولاً من سلالات hiss plus المأشابة المختارة في سدادات agar، ثم تُفصل الكروموسومات على هلام agar بتركيز 1% باستخدام مجال كهربائي متجانس ومحكم القيد (CHEF) عند درجة حرارة 14 درجة Celsius. وتُستخدم المعلمات التالية: الكتلة الأولى 14 درجة Celsius، وزمن التبديل 72 ثانية، ولمدة 15 ساعة بقوة 6 volts/cm، والكتلة الثانية 14 درجة Celsius، وزمن التبديل 122 ثانية، ولمدة 11 ساعة بقوة 6 volts/cm. وعند اكتمال الرحلان الكهربائي، يتم تصوير الكروموسومات عن طريق صبغ الهلام باستخدام بروميد الإيثيديوم (EtBr) لمدة 30 دقيقة، يليه التعريض للأشعة UV ثم إزالة الصبغة باستخدام الماء المقطر، وتُنقل الكروموسومات إلى غشاء موجب الشحنة عن طريق الخاصية الشعرية.

يتم التهجين في ظروف مسخنة باستخدام مسبار مُعلم بـ P 32 تم الحصول عليه عن طريق التمهيد العشوائي لنسيلة جينومية من bam H one bam H one بطول 1.8 kilobase تحتوي على جين hiss. Three، ثم تُفحص الكروموسومات عن طريق التصوير الشعاعي الذاتي أو التصوير الفسفوري. ويمكن حساب تردد الانتقالات الكروموسومية عن طريق قسمة عدد المستعمرات ذات التغذية الضوئية للهيستامين على العدد الإجمالي للخلايا الحية التي تم تحديدها عن طريق الزرع في وسط YPD.

في هذا المثال، يبلغ تردد إعادة الاندماج المحسوب حوالي 3%. يمكن إجراء مقايسة ترددات الانتقال المحفزة لـ ho باستخدام سلالات ذات أنماط جينية مختلفة لمقارنة الاختلافات في القدرة على إصلاح كسور الشريط المزدوج بواسطة شريط أحادي، كما هو موضح في هذا الرسم البياني التمثيلي. كانت ترددات الانتقال التي تم الحصول عليها بشكل انتقائي وغير انتقائي باستخدام السلالة متماثلة الزيجوت لـ RAD 51 delta null مختلفة إحصائياً عن تلك التي تم الحصول عليها باستخدام الظروف المقابلة مع السلالة البرية، سواء قبل أو بعد عملية الزراعة التحريضية.

يتم تحديد الكفاءات عن طريق قسمة العدد الإجمالي للخلايا الحيوية المكونة للمستعمرات على العدد الإجمالي للأجسام الخلوية في المزرعة، والذي يتم تحديده عن طريق العد باستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometer) كما هو موضح في هذا الجدول قبل وبعد الزراعة التحريضية. لم تكن الكفاءات مختلفة بشكل معنوي بالنسبة للخلايا من النوع البري، مما يشير إلى أن وجود أو غياب أي من كروموسومات الانتقال لا يؤثر على القدرة على البقاء بعد تكوين كسر مزدوج السلسلة (DSB).

يمكن فحص المستنسخات التي يُفترض أنها تحمل انتقالاً جينياً عن طريق تحليل لطخة ساوثرن الجينومية. يظهر هنا تمثيل رسومي للكروموسومات ذات الصلة قبل وبعد تكوين الانتقال الجيني. أحجام قطع التقييد التي تحتوي على التسلسلات ذات الصلة والناتجة عن هضم DNA الجينومي من السلالات الأبوية والمؤتلفة، والتي ظهرت في اللطخات عن طريق التهجين باستخدام مسبار BAM H one بطول 1.8 kilobase.

تُدرج المستنسخات الجينومية الثلاثة لـ His 3 بأزواج الكيلو-قاعدة لتحليل لطخة ساذرن. يتم هضم الحمض النووي الجينومي باستخدام إنزيم القطع BMH one، ثم يُهجن مع مسبار His 3 بطول 1.8 كيلو-قاعدة موسوم بـ P 32 لتصور هذه القطع التشخيصية.

قطع 0.8 kilobase HIS three delta 201.7 kilobase hiss three delta three prime و 4 kilobase T 3 15 و 5 kilobase T 15 three و 8 kilobase hiss three delta five prime. المسار A هو ثنائي الصيغة الصبغية الأصلي. المسار B هو مُعاد تركيب بنقل غير متبادل hiss plus والمسار C هو نقل متبادل his plus.

يمكن أيضاً استخدام تحليل BLO الصبغي المؤتلف لفحص المستنسخات التي تحمل انتقالات صبغية. يتم فصل الكروموسومات السليمة المُحضرة في سدادات الأجاروز عن طريق الرحلان الكهربائي، ثم تُصبغ الهلام ببروميد الإيثيديوم وتُفحص تحت الأشعة فوق البنفسجية. بعد ذلك، تُنقل الكروموسومات المفصولة إلى غشاء النايلون وتُهجن باستخدام مسبار بحجم 1.8 kilobase مُوسوم بـ P 32.

استُخدمت ثلاث مجسات لتصور الكروموسوم 1.1 megabase السليم، والكروموسوم 15.8 megabase T 15 three الناتج عن translocation، والكروموسوم 0.6 megabase T three 15 الناتج عن translocation، والكروموسوم 0.3 megabase السليم رقم ثلاثة. يمثل المسار A السلالة الأبوية، والمسار B يمثل recombinant من نوع his plus ذو translocation غير تبادلي، والمسار C يمثل recombinant من نوع his plus ذو translocation تبادلي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية تحديد تردد تكوين الانتقال الصبغي عقب كسور مزدوجة السلسلة محفزة بواسطة HO المتعددة.