الحفظ بالتبريد من أجنة الفئران التي التزجيج جلايكول الإثيلين ، واستنادا

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحفظ بالتجميد للأجنة الفأرية في النيتروجين السائل وإذابتها لاستعادة فئران حية. ويتم تحقيق ذلك عن طريق غمر الأجنة الفأرية أولاً في وسط موازنة، ثم نقلها إلى وسط التزجيج في أنبوب تجميد، وبعد ذلك وضعها في خزان نيتروجين سائل. ولاحقاً، يمكن إذابة الأجنة في وسط أسموزي مرتفع وتحضينها في وسط استزراع حتى يتم نقلها إلى إناث مستقبلة.

وفي الختام، أظهرت النتائج بقاء أكثر من 90% من الأجنة على قيد الحياة بعد الإذابة من التجميد الزجاجي، ومعدلات ولادة تتراوح بين 30 إلى 70% بعد نقل الأجنة. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أن مادة glycol الواقية من التجميد والنفاذة أقل سمية للأجنة من المواد الواقية من التجميد التقليدية. وسيقوم فني من مختبري بتوضيح الإجراء قبل البدء في هذا البروتوكول.

قم بتحضير جنينين لفأر يتكون كل منهما من خليتين في المزرعة، تم الحصول عليهما عن طريق التزاوج الطبيعي أو تقنيات IVF التقليدية، في أنبوب تجميد للتخزين النهائي، مع إضافة 50 µL من محلول تجميد الأجنة EF S 40. بعد ذلك، قم بتحضير طبق بتري بلاستيكي بمقاس 35 مم أو 60 مم يحتوي على 50 µL من EFS 20 في درجة حرارة الغرفة.

استخدم أنبوباً شعرياً زجاجياً لنقل ما يصل إلى 30 جنيناً إلى الطبق. احذر من نقل وسط الزرع. وأيضاً لضمان عدم جفاف الأجنة، ضعها في قاع القطرة.

بعد حوالي 60 إلى 90 ثانية، استخدم أنبوباً شعرياً لسحب الأجنة المجففة التي تظهر مورفولوجيا منكمشة. انقل هذه الأجنة إلى محلول EFS في أنبوب التجميد، مع نقل أقل كمية ممكنة من EFS 20.

بمجرد نقل الأجنة، اتركها لتستقر في EFS 40 لمدة دقيقة واحدة قبل تجميدها في النيتروجين السائل. وقبل إذابة الأجنة، ضع في طبق استزراع قطرتين على الأقل بحجم 10 µL من وسط استزراع أجنة ذي أسموزية عالية، مثل وسط M 16. ثم غطِّ القطرات بالكامل بزيت السيليكون أو الزيت المعدني، وضع الطبق في حاضنة ثاني أكسيد الكربون حتى وقت الاستخدام.

بعد ذلك، قم بتدفئة محلول TS one إلى 37 °C مع ارتداء قناع للوجه وقفازات مخصصة للتجميد. استخرج الأجنة من خزان النيتروجين السائل. الآن، افتح أنبوب التجميد بسرعة وتخلص من أي نيتروجين سائل في الخزان أو في أي حاوية مناسبة.

ثم انتظر لمدة 30 ثانية. الآن أضف 850 µL من محلول TS one الدافئ إلى أنبوب التجميد (cryo tube). قم بسحب المحلول وطرده بلطف حوالي 10 مرات لضمان ذوبانه بشكل متجانس.

بعد ذلك، انقل الحجم بالكامل إلى طبق بتري بلاستيكي بقطر 60 مليمتر، أو إلى زجاجة ساعة، وانتظر لمدة ثلاث دقائق حتى تتكيف الأجنة مع درجة حرارة الغرفة، حيث يجب أن تظل في هذه الدرجة طوال الفترة المتبقية من الإجراء. لا تستخدم جهاز تدفئة.

افحص الأجنة في الطبق سريعاً تحت مجهر ستيريو لمعرفة مظهرها في بداية هذه الحضانة. وبعد حوالي دقيقتين من الحضانة، قم بتغطيس الأجنة عن طريق هز الطبق بلطف حتى يتوزع الوسط على سطح الطبق. وفي الدقيقة الأخيرة من الحضانة، قم بإخراج ثلاث قطرات منفصلة بحجم 50 µL من محلول TS two في طبق.

عند انتهاء الثلاث دقائق، استخدم مجهراً ستيريو للتأكد من أن الأجنة قد انكمشت قليلاً. وإذا ظلت الأجنة منتفخة، استمر في الحضن لمدة تتراوح من دقيقة إلى ثلاث دقائق إضافية. الآن، التقط الأجنة باستخدام أنبوب شعري زجاجي وانقلها إلى القطرة الأولى من TS two.

انتظر لمدة ثلاث دقائق ثم انقل الأجنة إلى القطرة الثانية، تليها القطرة الثالثة. وأخيراً، استخرج طبق وسط الأجنة المُجهز والمخزن في الحاضنة، واستخدم أنبوباً شعرياً زجاجياً لنقل الأجنة إلى القطرة الأولى من الوسط.

عند فحص الأجنة باستخدام المجهر التشريحي، يجب أن تستعيد تدريجياً شكلها المورفولوجي الطبيعي. الآن، أعِد الطبق إلى الحاضنة لمدة 10 دقائق تقريباً. بعد ذلك، يتم غسل السكروز الذي انتقل من المرحلة الثانية من محلول TS.

انقل الأجنة إلى القطرة التالية من وسط الزرع. استمر في زرع الأجنة في حاضنة CO2 حتى يتم نقلها إلى uc للإناث المستقبلة. بعد التزجيج والاستعادة لما بين 300 و480 جنيناً من ثلاث سلالات مختلفة من الفئران، كانت نسبة البقاء على قيد الحياة عالية جداً.

بعد الإذابة، تراوحت نسبة الأجنة التي أظهرت شكلاً ظاهرياً طبيعياً بين 93 و 99%، ومن بين هذه الأجنة تطور 84% على الأقل إلى كيسات أرومية. لا تنسَ أن التعامل مع النيتروجين المسال قد يكون خطيراً للغاية، لذا يجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة لتجنب التلامس المباشر وتقليل التعرض له عن قرب. يجب دائماً التعامل مع النيتروجين من خلال اتباع هذا الإجراء.