واحدة رسم الخرائط ذات الصلة مصير الخليوي في الزرد

الهدف العام من التجربة التالية هو إجراء رسم خرائط للمصير وتتبع السلالات لخلايا مفردة مختارة في أجنة أسماك الزيبرا. يتم تحقيق ذلك عن طريق الربط الكيميائي للفلورسين المقيد بدكستران عالي الوزن الجزيئي. بعد ذلك، يتم حقن الدكستران الملحق بالفلورسين المقيد مجهرياً في أجنة أسماك الزيبرا، والذي يتم تنشيطه ضوئياً في خلايا مختارة باستخدام امتصاص الفوتونين.

بعد التنشيط الضوئي للأجنة، يتم إجراء تحليل كيميائي نسيجي مناعي للكشف عن ديكستران الفلوريسين الذي تم تحريره من القفص من أجل رسم خريطة مصير الخلايا المنشطة. وفي نهاية المطاف، يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد المساهمة السلالية والتوضع النسيجي للخلايا المفردة التي تم تنشيطها ضوئياً. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل المجهر الفلوري القياسي، في إمكانية استخدامها لوسم الخلايا المفردة بشكل تفاضلي لرسم خريطة المصير.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعدنا في الإجابة على أسئلة رئيسية في علم الأحياء النمائي، مثل كيفية مساهمة الخلايا السليفة غير المتمايزة في تكوين أنواع مختلفة من الأنسجة. ويعد التوضيح المرئي أمراً بالغ الأهمية لأن خطوات تثبيت الجنين والتنشيط الضوئي يصعب تعلمها بناءً على الوصف النصي وحده. قبل البدء، قم بتخليق ديكستران الفلوريسين المقيد (caged fluorescein dextran) وتخزينه في أنابيب مغطاة برقائق معدنية. ثم قم بحقن الأجنة مجهرياً في مرحلة الخلية الواحدة إلى الخليتين باستخدام ديكستران الفلوريسين المقيد الذي تم تخليقه.

بعد وصول الأجنة إلى مرحلة النمو المناسبة، قم بطلاؤها. ثم قم بتثبيت الأجنة المطلية في agarose منخفض الانصهار من أجل التنشيط الضوئي. وعندما يتصلب agarose، قم بتشغيل برنامج LSM 510.

ضع مرشحاً أصفراً شفافاً في مسار شعاع الضوء الأبيض، ثم اختر مسح صورة جديدة (scan new image) وانقر على بدء وضع الخبير (start expert mode). اختر علامة تبويب الليزر، وقم بتشغيل مصادر ليزر الأرجون والـ mi tai. اضبط الطول الموجي لـ mi tai على 740 nanometers.

بعد ذلك، اختر علامة التبويب config. قم بضبط تكوينات المسار البصري لأيون argonne وليزر mi tai. ثم اختر علامة التبويب scan.

قم بتغيير الشيئية إلى 20x0.8. اضبط أقصى سرعة للمسح النقطي من خلال النقر على وضع تعيين الحد الأقصى (max set mode) وطريقة الرقم إلى "mean" و "one" على التوالي. تحت علامة تبويب القنوات (channels)، قم بإلغاء تحديد جميع مصادر الليزر باستثناء mi tai. بعد ذلك، ضع مقياس القدرة في مسار الشعاع البصري، ثم اختر زر con لتنشيط المسح المستمر.

اضبط نسبة النفاذية حتى يقرأ مقياس القدرة متوسط قدرة ليزر يبلغ 47 milliwatts. ثم أوقف المسح بالضغط على زر الإيقاف الموجود أسفل علامة تبويب القنوات. قم بإلغاء تحديد مصدر ليزر mi tai وحدد argonne iron.

بعد ذلك، اختر زر fast XY مجدداً ضمن علامة تبويب القنوات (channels)، ثم اضبط الثقب (pinhole) وكسب الكشف (Detect gain)، والتدعيم والإزاحة (amplify a offset)، ثم التدعيم مرة أخرى لليزر الأرجون (Argonne iron laser) لتحقيق أفضل جودة للصورة. باستخدام وحدة التحكم في المنصة، ابحث عن الخلية المراد تنشيطها وقم بتركيز البؤرة عليها، ثم انقر فوق زر الإيقاف. باستخدام أداة القص، قم بقص الخلية المنشطة بحيث تظهر قيمة عامل القص (crop factor) ضمن علامة تبويب الوضع (mode) ما بين 50 و 70.

ثم أوقف عملية المسح عن طريق اختيار زر الإيقاف الموجود تحت علامة تبويب القنوات. قم بإلغاء تحديد ليزر أيونات الأرجون واختر ليزر My Tai تحت علامة تبويب الوضع. اضبط سرعة المسح على 31.46 ثانية.

ثم اختر الزر المنفرد لبدء المسح للتنشيط ثنائي الفوتون للفلوريسئين ديكستران المقيد في الخلية المختارة. وبعد التنشيط، انتقل إلى علامة تبويب القنوات، وقم بإلغاء تحديد ليزر mi tai ثم أعد تحديد ليزر الأرجون الأيوني. بعد ذلك، ومن قائمة الوضع، اضبط عامل التكبير على واحد. التالي.

تحت عنوان السرعة، انقر فوق زر max لضبط أسرع سرعة مسح. ولمراجعة المنطقة المنشطة ضوئياً، اختر fast xy. ثم اختر علامة تبويب القنوات (channels) واضبط الثقب (pinhole) ثم قم بالكشف مرة أخرى، وتأكد من أن المنطقة المنشطة ضوئياً لم تتعرض للاستئصال بالليزر.

بعد تحضير الأجنة المفعلة ضوئياً للكشف المناعي عن ديكستران الفلوريسين المحرر ضوئياً باتباع البروتوكول الموضح في المخطوطة المرفقة، اغسل الأجنة ست مرات في PBT ومرتين في محلول AP المنظم. ثم انقل الأجنة إلى أطباق ذات تسع فجوات تحتوي على محلول AP المنظم.

بعد ذلك، يتم سحب محلول AP buffer وإضافة N-B-T-B-C-I-P. ثم يتم إيقاف تطوير صبغة N-B-T-B-C-I-P عن طريق سحب محلول N-B-T-B-C-I-P. بعد ذلك، تُغسل الأجنة في محلول PBT.

الآن قم باستعادة الأجنة ورجّها على منصة دوارة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، كرر عملية الغسل بـ PBT مرتين إضافيتين. وأخيرًا، قم بتثبيت الأجنة في agarose منخفض الانصهار بتركيز 0.6% والتقط صورًا للخلايا المنشطة ضوئيًا باستخدام مجهر مركب رأسي.

في هذا الشكل، تظهر على اليسار صورة بالمجال المضيء (brightfield) وعلى اليمين صورة فلورية لجنين سمكة الزيبرفيش (zebrafish) الذي حُقن مجهرياً بسلسلة من الفلوريسين ديكستران المقيد (caged fluorescein dextran) قبل التنشيط الضوئي. وكما هو موضح هنا، تم تنشيط الجنين ضوئياً في إحدى القطع العضلية (somites) المشار إليها بالسهم في صورة المجال المضيء على اليسار، بطول موجي قدره 740 nanometers، وزمن مسح قدره 31 seconds، وقدرة ليزر متوسطة تبلغ 47 milliwatts. وفي الشكل الموجود على اليمين، يمكن ملاحظة الفلورة الناتجة عن الفلوريسين ديكستران غير المقيد بعد التنشيط الضوئي.

يظهر التلوين المناعي لـ fluorescein dextran غير المفعل في منطقة صغيرة من الصفيحة الجانبية في الأديم المتوسط لجنين في مرحلة الـ 10-somite، حيث تم تفعيلها ضوئياً باستخدام نفس معاملات الليزر المذكورة في الشكل السابق وباستخدام إجراء الكشف المناعي. ويمكن تحديد المنطقة المفعلة، كما يشير السهم هنا، مع وجود حد أدنى من تلوين الخلفية بعد اتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء تحليلات إضافية، مثل الصبغ المناعي لعلامات مختلفة خاصة بالأنسجة، من أجل توصيف موقع ومصير الخلايا الملونة بشكل أفضل. وتمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا الوعائية لدراسة أصل الخلايا السلفية الشريانية في الأوردة في أجنة أسماك الزيبرا النامية. ولا تنسَ أنه عند التعامل مع الكواشف الكيميائية مثل NBT وBCIP، فقد تكون هذه المواد خطيرة للغاية، لذا يجب ارتداء القفازات دائماً.