إإكسبلنتس قسيم أرومي لاختبار الالتزام مصير الخلايا أثناء التطور الجنيني

تستخدم الطريقة الموضحة في هذا الفيديو خرائط المصير لمرحلة الانقسام في جنين opus لتحديد خلية blaster واحدة واستزراعها بشكل منعزل لتقييم ما إذا كان التمايز الجنيني يتحدد من خلال تعليمات ذاتية أو خارجية؛ أولاً، يتم جمع أجنة في مرحلة الخليتين حيث ينصف أخدود الانقسام الأول المنطقة ذات الصبغة الخفيفة في نصف الكرة الحيواني. يتم استزراع هذه الأجنة، وعندما تصل الأجنة إلى 16 إلى 32 خلية، يتم إزالة الغشاء المحي، ثم تُفصل الخلايا المجاورة عن الخلية المختارة. ولغرض التفسير، يتم نقل خلية blaster المفصولة بعد ذلك إلى منخفض في بئر استزراع مغطى بمادة auger ويتم استزراعها.

بمجرد وصول المستنبت الجنيني إلى المرحلة المطلوبة، يتم حصاده لتقييم التعبير الجيني أو البروتيني باستخدام التهجين الموضعي أو QPCR أو الكيمياء النسيجية المناعية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالتقنيات الأخرى، مثل زراعة مجموعات كبيرة من الخلايا الجنينية أو زراعة الأعضاء، في إمكانية زراعة خلايا جنينية مفردة معروف المصير التطوري من خلال دراسات تتبع السلالة، دون الحاجة إلى عوامل نمو مضافة أو وجود خلايا مجاورة. وبالتالي، يمكن اختبار ما إذا كانت العوامل الجوهرية للخلية هي التي توجه تلك الخلية لتصبح سلفاً لنسيج معين، أو ما إذا كانت تتطلب إشارات من الخلايا المحيطة.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، حيث يتطلب تشريح Blairs ونقلها إلى آبار الزرع مناولات دقيقة تحت المجهر الستيريو. في هذا الفيديو، سأستخدم هذه الطريقة لتوضيح ما إذا كانت mRNAs المشتقة من الأم توجه الخلايا نحو مصير عصبي. العمل تحت مجهر التشريح. قم بشحذ أربع مجموعات من الملاقط باستخدام ورق صنفرة Illumina.

يُستخدم زوج واحد من الملاقط كاحتياطي في حال تضرر أحد الرؤوس أثناء الإجراء، وعقم جميع الملاقط الأربعة بواسطة الأوتوكلاف واحفظها في حاوية معقمة. قم بتحضير 500 milliliters من كل من محلول modified barth saline أو MBS بتركيز 0.1 x و 1.0 x ثم قم بتعقيمهما عن طريق الترشيح. تُحفظ هذه المحاليل في درجة حرارة تتراوح بين 14 إلى 18 degrees Celsius لعدة أشهر في زجاجة ذات غطاء لولبي. قم بتحضير agarose بدرجة electrophoresis بتركيز 2% في 100 milliliters من الوسط الزرعي بتركيز one X. استخدم الأوتوكلاف لإذابة agarose، واستخدم الميكروويف لإسالته عند الحاجة إليه لاحقاً بينما يكون agarose في الحالة السائلة.

صب حوالي 0.5 milliliters في قاع كل بئر من أطباق زراعة معقمة مكونة من 24 بئراً، وذلك لمنع التصاق الغرسات بالبلاستيك. بعد ذلك، صب حوالي اثنين إلى ثلاثة milliliters في قاع طبقين من أطباق بيتري بقطر 360 millimeter وقم بتحريكها بلطف للتوزيع.

ستعمل هذه كأطباق للتشريح، ويمنع الـ aros الأجنة من الالتصاق بالبلاستيك. بمجرد إزالة أغشيتها، وعندما يبرد الـ aros ويتصلب، قم بتسخين طرف ماصة باستير بطول ست بوصات باستخدام اللهب حتى ينصهر ويشكل كرة. أعد تسخين الكرة لفترة وجيزة، ثم لامسها بخفة على سطح الـ aros في إحدى فجوات طبق الزرع.

سيؤدي ذلك إلى تكوين منخفض ضحل يوضع فيه X explan. كرر هذه العملية لكل بئر في الطبق. بعد ذلك، املأ كل بئر من أطباق الزرع بـ 1 mL من وسط زرع معقم بتركيز 1x.

ثم املأ طبق التشريح بـ 0.1 XMBS لتسهيل فصل البلاستر. وبمجرد تحضير أطباق التشريح، انقل البويضات المخصبة بعد إزالة الأغلفة الهلامية إلى أطباق بتري سعة 100 millimeter تحتوي على 0.5 x من وسط الزراعة. ويمكن زراعة البويضات التي لن تُستخدم فوراً عند درجة حرارة 14 °C بينما يتم فحص الطبق الأول للبحث عن أجنة في مرحلة الخليتين.

افحص الأجنّة في طبق بتري الأول باستخدام مجهر تشريحي، وباستخدام ماصة نقل بلاستيكية، انقل حوالي 101 من الأجنّة في مرحلة الخلية الواحدة والخليةين إلى طبق منفصل مملوء بـ 0.5 x culture.Medium. ضع طبق بتري في حاضنة عند درجة حرارة 14 degree Celsius. تعتمد قدرة هذا المقايسة على تقييم الإمكانات التطورية للخلية بدقة على استئصال الجزء الصحيح بناءً على خرائط المصير.

لذلك، من الضروري اختيار الأجنة ذات نمط التصبغ الصحيح في مرحلة الخليتين، والتي تتوافق بالتالي مع أنماط الانقسام المنتظمة. كما هو موضح هنا، غالباً ما تحدث الانقسامات المنتظمة في جانب واحد فقط من الجنين.

لا يزال من الممكن استخدام هذه الأجنة كمتبرعين إذا كانت الخلية المتبرعة تنشأ من الجانب العادي. عندما تصل الأجنة إلى مرحلة الخليتين، يتم فرز تلك التي يقسم فيها أخدود الانقسام الأول المنطقة ذات الصبغة الخفيفة في نصف الكرة الحيواني إلى طبق منفصل، مع فرز عدد من الأجنة يزيد بنحو خمس مرات عن العدد الذي سيتم تشريحه. وستكون هذه الأجنة هي المتبرعات للمستأصل (explan).

احتفظ بالجنينين المتبقيين في مرحلة الخليتين في طبق منفصل بجانب الأجنة المانحة طوال الإجراء ليعملا كضوابط شقيقة لتحديد مرحلة المستأصل. بعد فرز الأجنة وتشريحها، عد إلى الأطباق في الحاضنة للعثور على المزيد من الأجنة في مرحلة الخلية الواحدة والخليتين. وبما أن الأجنة في مرحلة الخلية الواحدة تستغرق حوالي 90 دقيقة للانقسام، فيمكن القيام بذلك حتى ساعتين بعد جمع البويضات.

لتحضير العينة، ضع من 5 إلى 10 أجنة في طبق تشريح. ثم قم بوضع الجنين الأول بحيث يمكن الإمساك بالغشاء المحي a vitelline membrane باستخدام الملقط. عادةً لا يمكن رؤية هذا الغشاء، ولكن يمكن الإمساك به عند القطب الحيواني حيث ينفصل عن سطح الجنين بمسافة لؤلؤية واضحة.

باستخدام ملقط مدبب في إحدى اليدين، أمسك على مسافة من الجنين المراد تشريحه لتجنب إتلافه. ثم باستخدام ملقط مدبب في اليد الأخرى، أمسك الغشاء بالقرب من طرف الملقط الأول واسحبهما برفق في اتجاهين متضادين لنزع الغشاء. سوف يتسطح الجنين بمجرد إزالة الغشاء.

بعد ذلك، أمسك خلية مجاورة باستخدام الملقط واستخدم هذه الخلية كمقبض بحيث لا يتم لمس الخلية المراد تشريحها مباشرة بالملقط في اليد الأخرى، ثم اسحب الخلايا المجاورة المتبقية برفق بعيداً عن الجزء المراد استئصاله. وإذا كانت الخلايا المستهدفة هي خلايا خط الوسط التي تشترك في المصير نفسه، فيمكن إزالتها معاً كزوج. وأخيراً، قم بتشريح خلية المقبض وإزالتها.

التقط زوج الخلايا blastomere أو amere باستخدام ماصة باستورية زجاجية معقمة، مع تجنب فقاعات الهواء والشفط المفرط. ضع طرف الماصة الباستورية تحت سطح الوسط الزرعي في إحدى آبار طبق زرع X explan، ثم أخرج الـ blastomere برفق. من المفترض أن ينزلق إلى التجويف الضحل بفعل الجاذبية.

يمكن دمج الأجنة المستأصلة من أكثر من جنين واحد في شرحة واحدة عن طريق وضعها في نفس المنخفض في الوسط الزرعي. نكرر هذا الإجراء مع الأجنة المتبقية في طبق التشريح واحداً تلو الآخر. بعد حوالي 10 أجنة، سيمتلئ طبق التشريح بالبقايا الخلوية.

عندما يحدث ذلك، انتقل إلى طبق التشريح التالي. بعد الانتهاء من جميع عمليات التشريح، تحقق مما إذا كانت المستأصلات موجودة في المنخفضات الضحلة. وإذا لم تكن كذلك، يمكن دفعها برفق إلى داخل المنخفض باستخدام حلقة شعر تم تعقيمها في 70% Ethanol وتجفيفها بالهواء؛ ثم تُحضن الغرسات في درجة حرارة الغرفة على طاولة المختبر لمدة ساعة تقريبًا بعد آخر عملية تشريح.

قم بإزالة الحطام المحيط بالقطعة النسيجية الملتئمة باستخدام ماصة باستور زجاجية معقمة. ضع طبق القطعة النسيجية في درجة حرارة تتراوح بين 14 و20 درجة Celsius بجانب طبق بتري الذي يحتوي على الأجنة الضابطة الشقيقة. ستعمل الأجنة الشقيقة على تحديد مرحلة تطور القطعة النسيجية للبربوس.

بعد مرور حوالي ساعة إلى ساعتين في المزرعة، ستكون الخلايا الأرومية المنزوعة قد انقسمت حوالي أربع مرات وتخلصت من معظم الحطام المتبقي من الخلايا المجاورة التالفة. وبعد 20 ساعة، تشكل هذه الخلايا كرات خلوية صغيرة وقوية. وعندما تصل الأجنة الشقيقة إلى المرحلة التطورية المطلوبة، يتم حصاد النسيج المنزوع.

تظل هذه المستأصلات صامدة بشكل جيد، حتى لو تحللت بعض الخلايا. لذا، في حالة وجود كتلة عكرة في المزرعة، يتم فحصها باستخدام عروة شعر أو ملقط لتحديد ما إذا كانت هناك مستأصلة سليمة مدفونة بداخلها. يتم التقاط المستأصلة في حجم صغير من محلول المزرعة باستخدام ماصة زجاجية، ثم تُطرد بلطف في محلول تثبيت أو محلول تحلل خلوي مناسب للمقايسة المراد إجراؤها.

تم تشريح اثنين من أجنة blasphemers الظهرية أو اثنين من أجنة blasphemers البطنية في مرحلة 16 خلية، وزرعها في وسط XMBS واحد عند درجة حرارة 14 درجة Celsius حتى وصلت الأجنة الشقيقة إلى مراحل اللوحة العصبية المبكرة. تم فحص كل عينة للتعبير عن جين Sox two الزيجوتي في اللوحة العصبية عن طريق التهجين الموضعي، والذي يظهر كمنتج تفاعل أزرق اللون.

تظهر نتائج هذا المقايسة أن غالبية السلائف الظهرية للحيوان، والتي تُعد سلائف الصفيحة العصبية، يمكنها التعبير عن SOX two بشكل ذاتي؛ أي دون الحاجة إلى إشارات إضافية من مناطق أخرى في الجنين. أما تلك العينات التي لا تعبر عن SOX two فقد تكون قد حُددت بشكل خاطئ أثناء عملية التشريح.

في المقابل، لا يُعبر أي من الخلايا البلاستيّة الحيوانية البطنية (ventral animal blastomeres)، وهي سلائف البشرة البطنية، عن SOX two. وتشير هذه البيانات إلى أن الخلايا البلاستيّة الحيوانية الظهرية تمتلك قدرة ذاتية على تكوين نسيج عصبي، بينما لا تمتلك الخلايا البلاستيّة الحيوانية البطنية هذه القدرة. كما أظهرت بعض الخلايا الظهرية استطالة في الشكل المورفولوجي تشير إلى تكوين الأديم المتوسط الظهري.

تتلاشى هذه الخلايا الأرومية أيضاً لتكوين العقدة العصبية في الجنين السليم، كما يعبر مستنبت تفسيري عن بروتين علامة للعقدة العصبية لاختبار تأثير تغيير المستويات الداخلية لجين عصبي يتم التعبير عنه من الأم. تم حقن mRNA لـ Fox D5 في الخلايا الأرومية السليفة البطنية في مرحلة الخلايا الثمانية. وكما هو موضح هنا، عبرت غالبية الغرسات البطنية عن SOX2.

وعلى العكس من ذلك، عندما تم خفض المستوى الداخلي لـ Fox D five عن طريق حقن oligonucleotides morph مضادة للمعنى في السلائف الظهرية لـ blastomeres المكونة من ثماني خلايا، عبرت قلة قليلة فقط من الـ dorsal explants عن SOX two. وتشير هذه التجارب إلى أن التعبير الأمومي لـ Fox D five يلعب دوراً في القدرة الجوهرية للـ dorsal blastomeres على اكتساب مصير عصبي قبل هذا الإجراء. ويمكن تنفيذ طرق أخرى، مثل الحقن في الـ blastomeres المراد تشريحها، سواء باستخدام mRNAs لتحقيق اكتساب الوظيفة (gain of function) أو oligonucleotides morph مضادة للمعنى لتحقيق فقدان الوظيفة (loss of function)، للإجابة على أسئلة إضافية.

على سبيل المثال، ما هي الجينات المشاركة في القدرة الجوهرية للخلايا على تكوين مصير نمائي محدد؟ بالإضافة إلى ذلك، يمكن اختبار عوامل إرسال إشارات معروفة عن طريق إضافة عوامل منقاة إلى وسط المزرعة. كما يمكن استخدام هذا النهج لنقل بلستوفورات فردية إلى مواقع جديدة في الجنين السليم.

يختبر هذا الإجراء ما إذا كانت الخلية المزروعة ملتزمة بمصيرها التطوري الأصلي، وتعد هذه المعلومات بالغة الأهمية لتحديد الآليات الخلوية التي تجعل الخلية الجنينية متعددة القدرات تلتزم بأن تصبح سلفاً لنسيج محدد.