خفض التحميل : أداة مفيدة لفحص مدى تقاطع الفجوة بين الخلايا العصبية توصيلات الراسم الشبكية

الهدف العام من تجربة تحميل القطع التالية هو فحص مدى اقتران متتبع الوصلات الفجوية بين العصبونات في الشبكية السليمة تحت ظروف إضاءة محكومة. وتتم الخطوة الأولى عن طريق قطع الشبكية باستخدام شفرة حادة مغموسة في محلول neuro biotin، وهو جزيء متتبع يمكنه الانتشار عبر قنوات الوصلات الفجوية المفتوحة، ولكن ليس عبر الأغشية الخلوية. وفي الخطوة الثانية، يتم تحضين الشبkiات في محلول ringer، مما يسمح بانتشار المتتبع عبر قنوات الوصلات الفجوية المفتوحة.

إذا كان الاقتران عبر الفجوات الموصلة ضعيفاً، فسوف يقتصر وميض النيوروبيوتين الفلوري على العصبونات الشبكية القريبة من القطع. وفي المقابل، إذا كان الاقتران عبر الفجوات الموصلة قوياً، فسيتم رصد الوميض الفلوري في العصبونات الشبكية البعيدة عن القطع. وتكمن الميزة الرئيسية لتحميل المادة عبر القطع مقارنة بالتقنيات المتاحة في سهولة تنفيذها على العصبونات ذات الأجسام الخلوية الصغيرة في أنسجة الشبكية العصبية السليمة.

كما أنه من الأسهل التحكم في ظروف الإضاءة أثناء تحميل القطاعات مقارنةً بدراسة الفيزيولوجيا الكهربائية للعصبونات المنفردة في أنسجة الشبكية السليمة. وبما أن المحفزات الضوئية المستخدمة أثناء التسجيل الكهربائي يمكن أن تؤدي بحد ذاتها إلى تغيرات في اقتران الفجوات، فإن هذه التقنية سيقوم بتطبيقها الدكتور تشو تشوي، وهو باحث ما بعد الدكتوراه في مختبري. في هذا الإجراء، يتم الاحتفاظ بالسمكة الذهبية في ظلام تام خلال النهار لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل الجراحة، كما تُنفذ جميع الخطوات التالية، وصولاً إلى تثبيت أنسجة الشبكية، خلال النهار في ظلام تام؛ حيث يتم تخدير السمكة الذهبية تخديراً عميقاً بإضافة 150 milligrams per liter من ميثان سلفونات إلى مياه الحوض.

بعد ذلك، يتم التضحية بالسمكة الذهبية وفقاً للإرشادات الفيدرالية والجامعية وإزالة مقلتي العين بعناية. ثم يتم إزالة الجزء الأمامي من كل مقلة عين. بعد ذلك، توضع قطعة من ورق الترشيح فوق الجزء الخلفي من العين، ثم يُقلب ورق الترشيح والعين بحيث يصبح ورق الترشيح أسفل الجزء الخلفي من العين.

الآن، قم بإزالة الجزء الخلفي من العين بلطف، بما في ذلك الصلبة والظهارة الصبغية من سمكة goldfish المتكيفة مع الظلام. قم بقطع العصب البصري للشبكية باستخدام مقص دقيق. يجب الآن تثبيت شبكية سمكة goldfish العصبية، بحيث يكون جانب المستقبلات الضوئية للأعلى، على ورقة الترشيح قبل استئصال العين، بينما تخضع السمكة للتخدير في 5 mL من محلول ringer القائم على الكربونات والمؤكسج، مع أو بدون العقار المختبر، في كل بئر من أطباق ذات ستة آبار، وذلك بعد تشريح الشبكية العصبية السليمة من الجزء الخلفي للعين.

انقل الشبكيات إلى الآبار في ظلام تام. ثم أحكم إغلاق الآبار باستخدام البارافورم واترك النسيج ليتنقع لمدة 30 دقيقة. قم بتحضير 100 µL من محلول التتبع عن طريق إذابة 0.5% neuro biotin في محلول رينجر مباشرة قبل إجراء القطع في الشبكية.

بعد ذلك، أضف محلول neuro biotin إلى طبق بتري زجاجي. ثم قم بالنقر بلطف على ورق الترشيح المثبتة عليه الشبكية فوق منشفة ورقية. لإزالة فائض محلول ringers، اغمس شفرة حلاقة في محلول neuro biotin وقم بإجراء قطع شعاعي عمودي عبر الشبكية وورق الترشيح.

بعد ذلك، اغمس شفرة الحلاقة في محلول neuro biotin مرة أخرى واقطع الشبكية للمرة الثانية. كرر هذه العملية حتى أربعة قطوع لكل شبكية. في هذه الخطوة، انقل الشبكية إلى محلول ringers جديد، وهو وسط بوجود أو غياب الدواء المختبر لمدة 15 minutes للسماح بالتحميل والانتشار.

اغسلها ثلاث مرات بمحلول رينجر الطازج، سواء كان وسطاً يحتوي على العقار المختبر أو بدونه، لمدة خمس دقائق في كل مرة. بعد ذلك، قم بتثبيت الشبكية باستخدام 4% para formaldehyde في محلول منظم من الفوسفات بتركيز 0.1 molar في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. لاحقاً، اغسل الشبكية باستخدام 0.1 molar PBS طوال الليل عند درجة حرارة أربع درجات مئوية عن طريق وضعها في الثلاجة حتى اليوم التالي.

قم بتفاعل الشبكية مع 2% streptavidin Alexa 4 88 في PBS بتركيز 0.1 molar و 0.3% Triton X 100 ليكون التركيز النهائي 10 micrograms per milliliter، ثم تُحضن طوال الليل عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. وفي اليوم التالي، تُغسل الشبكية ثلاث مرات باستخدام 0.1 molar PBS في درجة حرارة الغرفة، ولمدة 10 دقائق في كل مرة.

افصل الشبكية عن ورقة الترشيح في محلول PBS. بعد ذلك، وباستخدام فرشاة دقيقة، قم بتثبيت الشبكية بحيث يكون جانب المستقبلات الضوئية للأعلى على شريحة زجاجية باستخدام وسط تثبيت vector shield. انقل الشريحة إلى مجهر ماسح ليزري بؤري والتقط صوراً بنفس دقة التكبير والإعدادات لكل حالة تجريبية، بحيث يمكن إجراء مقارنات لتأثيرات الظروف التجريبية المختلفة على مدى اقتران المقتفي الوظيفي للفجوات.

يوضح هذا الشكل مدى اقتران مقتفي أثر الخلايا المستقبلة للضوء خلال النهار في ظلام مستمر مقارنة بالنهار في ظلام مستمر بوجود مضاد انتقائي لمستقبل الدوبامين D2. يلاحظ أن القطع بالشفرة في كلتا الصورتين يظهر على اليسار. وعلى الرغم من أن صورة واحدة قد تحتوي على جميع الخلايا المصبوغة، إلا أنه يُوصى بجمع مجموعة من الصور المقطعية (Z stack) للمنطقة المراد دراستها ودمجها في صورة واحدة كما هو موضح.

يوضح هذا مدى اقتران متتبع الخلايا المستقبلة للضوء مع الانتقال بالتسلسل عبر مقطع "Zack" كهذا. لاحظ أن القطع بالشفرة في هذه الصورة يقع على اليمين. ولتحديد كمية مدى اقتران المتتبع في متصفح صور LSM، افتح الصورة، ثم انقر فوق تصدير (export) واحفظ الصورة كملف TIF 16 bit غير مضغوط؛ ويجب تضمين شريط المقياس في صورة TIFF هذه باستخدام برنامج NIH image J.

قم بقياس شدة الفلورة لـ neuro biotin المسمى بـ Alexa 4 88 من صور منخفضة التكبير لشبكيات العين المثبتة بالكامل. افتح ملف TIFF باستخدام برنامج Image J ثم ارسم خطاً مستقيماً يتوافق مع شريط المقياس. بعد ذلك، انتقل إلى analyze، ثم set scale، وأدخل المسافة المعروفة ووحدة الطول.

بعد ذلك، انقر على موافق. الآن يمكن عرض قياسات الفلورية بوحدات معايرة مثل المليمترات. عقب ذلك، حدد المنطقة المراد دراستها باستخدام أداة التحديد المستطيلة.

يجب وضع ذروة الفلورسنت عند الحد الأيسر من التحديد الخاص بك. تأكد من عدم وجود إشارة فلورية بالقرب من الحد الأيمن. انقر فوق "analyze and plot profile" لبيانات التحكم النهارية التي تم الحصول عليها في ظلام تام.

يظهر منحنى ذو اضمحلال أسي من اليسار إلى اليمين. بعد ذلك، انقر فوق "نسخ" في النافذة المنبثقة ثم الصقه في برنامج Excel. سيظهر الآن عمودان، أحدهما يوضح المسافة من مكان القطع، والآخر يوضح شدة الفلورة كدالة في المسافة من مكان القطع.

وكإجراء للمقارنة، تُكرر الخطوات المذكورة أعلاه باستخدام البيانات التي تم الحصول عليها في ظلام تام خلال النهار. وفي وجود spit bro، تُقسم كل قيمة فلورة خام على القيمة القصوى للفلورة للحصول على كثافة الفلورة النسبية. يتم نسخ العمودين المقابلين للمسافة من مكان القطع وكثافة الفلورة النسبية، ثم لصقهما في برنامج origin.

تظهر هذه الخطوات لكل من مجموعة الضبط النهارية والعينة اللعابية النهارية. يتم مطابقة البيانات المسجلة عند هذه النقطة مع دالة الاضمحلال الأسي رقم واحد، ثم تُقارن قيم ثابت الفراغ في الظروف التجريبية المختلفة باستخدام اختبار T-test أو ANOVA.

تظهر الدوال الأسية والتحليلات الإحصائية لبيانات التحكم النهارية، وبيانات الـ pip rone النهارية، وبيانات التحكم الليلية للمقارنة. موضحة هنا أمثلة على مدى اقتران متتبع الخلايا المستقبلة للضوء في شبكية السمكة الذهبية المتكيفة مع الظلام في النهار A، وفي الليل B، وفي النهار بوجود one وهو مضاد انتقائي لمستقبلات الدوبامين D two، كما كشفت تقنية التحميل بالقطع. وقد التُقطت جميع الصور المجهرية البؤرية باستخدام الإعدادات نفسها لأغراض المقارنة.

في هذا الرسم البياني، يتم تمثيل شدة الفلورية لثلاث حالات تجريبية كدالة في المسافة من مكان القطع، وتم تمثيلها باستخدام الدالة الأسية. تُستخدم تقنية التحميل بالقطع (cut loading technique) لكمية اقتران مقتفي أثر الوصلات الفجوية عن طريق حساب قيم الثابت المكاني كما هو موضح هنا لثلاث حالات تجريبية. كما يمكن استخدام تقنية التحميل بالقطع لدراسة المشابك الكهربائية بين أنواع الخلايا الأخرى في الشبكية وفي الأنواع الأخرى.

على سبيل المثال، يوضح هذان الشكلان أن الخلايا الأفقية من النوع A والنوع B في الأرنب تظهر اقترانًا للمقتفيات المتماثلة بعد عملية التحميل بالقطع وانتشار النيوروبيوتين في ظل ظروف التكيف مع الظلام. لقد استخدمنا تقنية التحميل بالقطع لدراسة مدى انتشار المقتفيات عبر الفجوات الموصلة بين الخلايا النبوتية والمخروطية في النهار والليل. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذه التقنية لتحديد ما إذا كان اقتران المقتفيات بين الخلايا العصبية الشبكية الأخرى يخضع لتحكم الساعة الشبكية و/أو ظروف إضاءة وظلام محددة.

كما يمكن استخدامه لدراسة اقتران المقتفيات بين العصبونات في مناطق أخرى من الدماغ.