دراسة الهيكل الخلوي أكتين في الخلايا البطانية لايف تعرب عن GFP - أكتين

الهدف من هذا الإجراء هو مراقبة التغيرات الديناميكية في الهيكل الخلوي للأكتين في الخلايا البطانية الحية. أولاً، يتم إجراء ترانسفكشن للخلايا البطانية في الوريد السري البشري باستخدام بلازميد A GFP beta actin، ثم تزرع حتى تصل إلى مرحلة التلاقي على شرائح غطاء. بعد ذلك، توضع شرائح الغطاء في غرفة تصوير الخلايا الحية المزودة بمنصة مسخنة ونظام ضخ لمحلول ملحي فسيولوجي يحتوي على الألبومين.

تتمثل الخطوة النهائية في الحصول على البيانات لمنطقة مختارة من الخلايا عبر التقاط صور بنظام الفاصل الزمني (time-lapse) قبل وبعد المعالجة بعامل دوائي. ويمكن أن يوفر تحليل الرسوم البيانية (Chime graph) باستخدام برامج التصوير مثل Image J رؤى حول نتوءات الأقدام الصفائحية (lamely podia) الموضعية، مثل المسافة، والزمن، وسرعة النتوءات، بالإضافة إلى حركة ألياف الأكتين بمرور الوقت. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل التصوير المناعي الفلوري، في أن تصوير الخلايا الحية يسمح بدمج الطبيعة الديناميكية للأكتين والهيكل الخلوي في دراسات الآليات التي تحدد النفاذية البطانية.

بينما تمثل الخلايا المصبوغة والمثبتة لقطات زمنية ثابتة وتوفر معلومات محدودة عن ديناميكيات الفعل والهيكل الخلوي قبل وبعد المعالجة بوسطالتهاب، يتم العمل داخل غطاء سلامة بيولوجية. تُعقم شرائح التغطية باستخدام ethanol 70% لمدة دقيقتين ثم تُترك لتجف في الهواء. توضع كل شريحة تغطية في طبق زراعة بحجم 10 سنتيمتر، ويُضاف 300 µL من محلول الجيلاتين الدافئ في المركز دون لمس حواف شريحة التغطية. بعد مرور خمس دقائق، يتم سحب السائل.

قم الآن بحصد مستنبت متلاحم من الخلايا البطانية لوريد السرة البشري أو VE باستخدام 0.25%tripsin EDTA. قم بعدّ الخلايا ثم قم بترسيبها عن طريق الطرد المركزي. اسحب أكبر قدر ممكن من وسط SUP natum من أجل إجراء تفاعل ترانسفكشن باستخدام مجموعة VE nuclear effector kit.

أعد تعليق كرات الخلايا في محلول المؤثر النووي الأساسي وأضف من 0.2 إلى 2 µg من بلازميد ناقل GFP beta actin. انقل 100 µL من معلق الخلايا إلى أنبوب nuclear effector qve. قم بالنقر على الأنبوب المغطى عدة مرات للتأكد من عدم وجود فقاعات بين قاع الـ Q vet وعينة ترانسفكشن.

ضع Q VET في جهاز nuclear effector two وقم بتشغيل البرنامج A 0 3 4، وباستخدام ماصة نقل من مجموعة nuclear effector kit، انقل 500 µL من وسط EGM two MV الدافئ إلى qve. بعد ذلك، انقل المزيج مرة أخرى إلى أنبوب micro fuge واتركه في الحاضنة لمدة 15 دقيقة. اخلط معلق VE المنقول جزيئياً برفق مرة واحدة، ثم ضع 300 µL من المعلق على شريحة غطاء مطلية بالجيلاتين دون لمس الحواف.

ثم يتم التحضين لمدة تتراوح من ساعة واحدة إلى أربع ساعات. افحص الخلايا التي تم نقل الجينات إليها للتأكد من التصاقها بالشريحة الغطائية. بعد ذلك، أضف 10 milliliters من وسط E GM two MV إلى الطبق، واستمر في التحضين للتعبير عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP).

أولاً، أضف وسط محلول ملحي فسيولوجي بالألبومين أو PSS إلى نظام التدفق بالجاذبية وقم بتوصيله بالسخان المدمج. الآن، اضبط منظم التدفق لتحقيق معدل تدفق يبلغ 40 milliliters per hour تقريباً. ثم أوقف التدفق عن طريق إغلاق صنبور التوقف باستخدام مسحة قطنية.

ضع شحم التفريغ على الحافة الخارجية للجانب السفلي من حمام الماس. الآن، أخرج مزرعة مُحوّلة من الحاضنة. ارفع غطاء الشريحة برفق باستخدام الملقط.

ثم باستخدام منديل Kim wipe، قم بامتصاص فائض وسط EGM two MV من الشريحة السفلية، مع جعل وجه الخلايا للأعلى. ضع الحمام الماسي فوق غطاء الشريحة لتكوين حجرة. ضع الحجرة بسرعة في مسخن المسرح.

أحكم ربط المشابك فوق الغرفة، ثم اسحب باستخدام الماصة حوالي 1 mL من وسط EGM two MV من الطبق إلى داخل الغرفة. الآن، قم بتوصيل خرطوم التفريغ بحامله الموجود على الجانب الأيسر من الغرفة، وخط A PSS من السخان المدمج في القناة الموجودة على الجانب الأيمن من الغرفة. بعد ذلك، قم بتشغيل جهاز التفريغ وافتح خط A PSS للسماح بتروية الحمام فوق الخلايا المنقولة جينيًا.

قم أيضاً بتشغيل السخان المدمج عند 37 درجة Celsius. بعد ذلك، ضع مسبار الثرمستور الخاص بالمنصة المسخنة في الحمام عند الحافة، وقم بتشغيل سخان المنصة عند 37 درجة Celsius. لإزالة أي بقايا من وسط EGM two MV وتراكمات الفرز، امسح الجانب السفلي من غطاء الشريحة بعناية باستخدام منديل Kim wipe مبلل بـ 70% ethanol، ثم اتبعه بمنديل Kim wipe جاف. اترك خلايا HU المنقولة جينياً لتتوازن لمدة 30 دقيقة.

قم بتثبيت المسار. ركّز على المنطقة المختارة من الخلايا المستزرعة للدراسة. اضبط وقت تعريض الكاميرا بين 0.5 وثانيتين، بناءً على كثافة إشارة GFP Act في الخلايا.

قم أيضاً بتحديد الفترات الزمنية ومدة التجربة. والآن، بعد إطفاء أضواء الغرفة، التقط صورة واحدة لتقييم الإعدادات. ابدأ بالتقاط سلسلة الصور بنظام الفاصل الزمني (time lapse) مع مراقبة الصور وفقاً للمتطلبات.

في البروتوكول النموذجي، يتم الحصول على صور خط الأساس لمدة تتراوح من 20 إلى 30 دقيقة قبل إضافة العامل المختبر، يليه استحواذ إضافي على الصور لمدة تتراوح من 0.5 إلى أربع ساعات. وأخيرًا، وكما هو مفصل في النص المرفق، يتم تقييم مسافة بروز الأقدام الصفائحية (lamely podia) واستمراريتها وسرعتها من خلال تحليل الرسم البياني CH. وفي التجربة النموذجية، يتم التعبير عن GFP actin في أكثر من 50% من الخلايا البطانية (VE) المنقولة بطريقة عشوائية.

التقطت هذه الصور التي تم الحصول عليها بمعدل صورة واحدة كل دقيقة بروتين GFP actin في جميع أنحاء السيتوبلازم، وكذلك في التراكيب الخيطية وفي الأقدام الكاذبة المحلية البارزة على طول حافة الخلية. ويتم قياس ثبات المسافة وسرعة البروزات الخلوية من خلال مجموعات الصور المتقاطعة زمنياً. وباستخدام تحليل chm graph، يتم أولاً رسم خط يتكون من بكسل واحد يكون عمودياً تقريباً على حافة الخلية.

يتم استخلاص هذه المنطقة من كل صورة في مجموعة التصوير المتقطع (time-lapse) لإنشاء تجميع صوري (montage) للمنطقة بمرور الوقت أو رسم بياني للكرونولوجيا (chime graph)؛ حيث تُمثّل النتوءات في الرسم البياني للكرونولوجيا، من المنظور الممتد من اليسار إلى اليمين، كحركات صاعدة في حافة الخلية. وعند وضع خط فوق حافة أحد هذه النتوءات، يمكن جمع بيانات البكسل المرتبطة بهذا الخط لقياس ديناميكيات النتوءات كمياً. ويمكن استخدام العدد الإجمالي للنتوءات في الرسم البياني للكرونولوجيا لتقدير تردد ظهور النتوءات.

يصور هذا التحليل حركات ألياف الإجهاد التي تتشكل بالقرب من محيط الخلية وتتحرك نحو مركز الخلية حيث يتم تفكيكها في النهاية. في رسم الكيوف (chio graph)، تظهر ألياف الإجهاد كخطوط مستمرة في المنطقة السيتوبلازمية، وغالباً ما تتحرك للأسفل وإلى اليمين باتجاه مركز الخلية؛ وعندما يصعب رؤية الألياف في رسم الكيوف الأصلي، يقوم مرشح القناع غير الحاد (unsharp mask filter) بشحذ الصورة، وتسهل الخطوط المرسومة على ألياف الإجهاد جمع بيانات البكسل باستخدام وظيفة القياس. وبدلاً من ذلك، فإن الخطوط المرسومة من بداية ألياف الإجهاد المحددة إلى نهايتها تعطي متوسط بيانات البكسل الكتلي للمدة التي لوحظت فيها الليفة.

أوضح هذا العرض التقديمي كيفية تحليل البيانات المستمدة من مجموعة صور الفاصل الزمني عبر تحليل الرسوم البيانية باستخدام برامج مثل Image J. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية دراسة ديناميكيات الهيكل الخلوي للأكتين استجابةً للوسائط الالتهابية باستخدام التصوير الحي للخلايا المبطنة المُنقولة جينياً.