PDMS تصنيع الأجهزة وتعديل السطح

اسمي كين كوتز، وأنا باحث في مرحلة ما بعد الدكتوراه هنا في مركز Bio MAs Resource Center التابع لمستشفى ماساتشوستس العام. يتضمن مشروعي البحثي الرئيسي عزل الخلايا المتعادلة (neutrophils) باستخدام جهاز التقاط بالألفة المناعية يحتوي على هياكل مائعية دقيقة.

نستخدم هذا الجهاز في خمس مستشفيات مختلفة في جميع أنحاء البلاد لعزل RNA من أجل التحليل الجينومي اللاحق. وبشكل أساسي، يتكون ما لديكم من قالب رئيسي من مادة SU8 المقاومة للضوء فوق طبقة من السيليكون. سنقوم بصب بوليمر مرن ثنائي المكونات وهو PDMS فوق ذلك القالب الرئيسي، حيث سيشكل PDMS قالباً.

نقوم بإخراج القالب الرئيسي من حافظته ونضعه في طبق بتري. يتم تثبيت القالب الرئيسي باستخدام شريط لاصق في قاع طبق بتري. وباستخدام الميزان، نقوم بوزن خليط من PDMS والمصلد والراتنج الأساسي.

تبلغ النسبة جزءاً واحداً من المصلد إلى 10 أجزاء من الراتنج. عادةً، وبالنسبة للأجهزة التي تم قصها، نقوم بوزن 20 إلى 30 جرام من الراتنج، ومن اثنين إلى ثلاثة جرام من المصلد على التوالي. بعد سكب كل من المصلد والراتنج في وعاء وزن صغير، نستخدم شوكة بلاستيكية قياسية لخلطهما معاً.

يجب التأكد من الخلط بقوة وطي المزيج فوق بعضه البعض لضمان توزيع المصلد بشكل متساوٍ داخل الراتنج. وعادةً ما نقوم بمراقبة مدى جودة خلط المكونين؛ حيث نحاول، من خلال مراقبة عدد فقاعات الهواء، الوصول إلى توزيع متساوٍ لفقاعات هواء صغيرة في جميع أنحاء الإلاستومر.

بعد ذلك، نصب مادة PDMS فوق قالب SU-8 الموجود في طبق بتري. نضع القالب وفوقه مادة PDMS داخل جرة فراغية، ثم نقوم بتفريغ الحجرة من الهواء لإزالة الفقاعات الهوائية التي اختلطت بالمادة. عادةً ما تستغرق عملية إزالة الغازات من 30 دقيقة إلى ساعة واحدة.

بعد عملية إزالة الغازات، نقوم بإخراج الأجهزة من غرفة التفريغ ونضعها في فرن عند درجة حرارة 65 إلى 80 °C. الحد الأدنى لوقت المعالجة عند درجات الحرارة هذه هو من ثلاث إلى ست ساعات. وفي مختبرنا، نترك الأجهزة عادةً في الفرن طوال الليل.

عادةً ما نستخدم مشرطاً جراحياً من الفولاذ مقاس 11. نقوم بإجراء قطع مستقيمة لعمق نصف سنتيمتر تقريباً من حافة القالب الرئيسي السيليكوني، ونقطع حول حافة القالب الرئيسي لتشكيل قرص كبير. ثم نقوم بنزع قالب PDMS من القالب الرئيسي ونضعه بحيث يكون جانب التفاصيل متجهاً للأعلى في طبق بتري نظيف.

نخرج القالب المتحرر من طبق بتري ونضعه على سطح قطع باستخدام سكين أو سكين مثبت على سكة خطية. نقوم بتقطيع الأجهزة الموجودة في القالب، ثم يُعاد وضع كل جهاز مقطع في طبق بتري من أجل معالجته بشكل أكبر.

عادةً، لربط أجهزتنا بالسوائل، نقوم بثقب ثقوب في جهاز PDMS. والجهاز الذي نستخدمه لثقب الثقوب هو سرنجة قياسية سعة 3 مل. ويوجد في طرف السرنجة سعة 3 مل إبرة من الفولاذ المقاوم للصدأ ذات طرف غير مدبب.

يوجد سلك داخل الإبرة المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ يتناسب مع القطر الداخلي للإبرة. هذا السلك متصل بمكبس المحقنة. من خلال سحب المكبس إلى الخلف وتراجع تلك الإبرة، يمكنك ثقب فتحة أو استئصال سدادة من الـ PDMS. اقلب جهاز الـ PDMS وقم بإخراجه عن طريق الضغط على المكبس.

يكمن السر في استخدام أدوات الثقب في الحفاظ على المكبس عمودياً قدر الإمكان وعدم تدوير أداة الثقب على الإطلاق. عند الثقب عبر الـ PDMS، قم برفع الجهاز بالكامل، أي جهاز الـ PDMS بأكمله باستخدام ملقط، ثم اقلبه واطرد السدادة عن طريق الضغط لأسفل على المكبس. ثم التقط السدادة باستخدام ملقط وتخلص منها.

بعد ذلك، قم بسحب المكبس مرة أخرى، ثم اقلب الجهاز للأسفل واسحب أداة القطع. كرر هذه العملية حتى تنتهي من ثقب جميع الفتحات المطلوبة. وبالنسبة لعملية الربط، نقوم بربط أجهزة PDMS بالشرائح الزجاجية.

بالنسبة لأجهزتنا، سنقوم بربط PDMS بشرائح زجاجية برابطة غير عكسية أو ربط تساهمي. ويتم تحقيق ذلك عن طريق وضعها في جهاز plasma Asher وتعريضها لبلازما أكسجين تفاعلية. وتتمثل خطوات تنفيذ ذلك في أخذ جهاز PDMS ووضعه على صينية جهاز plasma Asher.

مع توجيه ميزات الجهاز إلى الأعلى، يمكنك استخدام أي شريحة مجهر زجاجية قياسية. نحن نستخدم شريحة مجهر أكبر قليلاً بحجم بوصة ونصف لتناسب جهازنا. ويمكنك استخدامها مباشرة من العبوة.

نفضل معالجتها باستخدام محلول بيرانا (piranha solution)؛ حيث يعمل ذلك على إزالة أي ملوثات عضوية قد تكون موجودة على سطح الشريحة الزجاجية. وبعد وضع الجهاز والشريحة الزجاجية فوق صينية جهاز تنظيف البلازما (plasma Asher)، يتم إدخال الصينية في الجهاز وتعريضها لبلازما الأكسجين التفاعلية.

بعد اكتمال برنامج جهاز تنظيف البلازما (plasma Asher)، نفتح الغرفة وننقل اللوحة التي تحتوي على أجهزتنا إلى سطح المختبر. وباستخدام الملاقط، نرفع جهاز PDMS بعناية، مع الحرص على عدم لمس أسطح الترابط بأصابعنا. نقوم بقلب جانب الترابط على الشريحة الزجاجية، ثم نتأكد من عدم وجود فقاعات هواء بين PDMS والشريحة الزجاجية.

نضع جهاز PDMS الملتصق الآن بالزجاج على لوح تسخين عند درجة حرارة 65 إلى 75 °C لمدة 10 دقائق لتحقيق رابطة كيميائية أفضل. لذا، في هذا القسم، سنقوم بتعديل أسطح PDMS والزجاج كيميائياً؛ فبعد عملية الربط في الغرفة النظيفة، يتبقى لدينا سطح PDMS يحتوي على مجموعات OL التفاعلية على السطح. نحن بحاجة إلى هذا السطح التفاعلي لأنه محب للماء، وسينتشر في النهاية إلى داخل كتلة PDMS.

لذا، من الأفضل إجراء الكيمياء السطحية مباشرة بعد المعالجة بالبلازما؛ حيث سنستخدم محلولاً بتركيز 5% من الـ me capto. وهو عبارة عن three me capto, propyl, trimeth oxy. هذا محلول بنسبة 5% حجماً، وما نقوم به أساساً هو حقنه في المدخل والتأكد من ملء الجهاز تماماً دون وجود أي فقاعات هوائية.

في حال وجود أي فقاعات هوائية، يتم دفعها للخارج باستخدام الملقط. بعد ذلك، وبمجرد حقن الـ slan، يُترك المزيج لمدة تتراوح من 15 إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وعادةً ما يتم حقن حجم ثانٍ من الـ slan بعد 10 دقائق من بدء التفاعل.

بعد أن يتفاعل السيليل لمدّة نصف ساعة تقريبًا، سنقوم بشطف جميع الأجهزة بما يعادل ثلاثة إلى أربعة أحجام من الجهاز من الإيثانول النقي. وسنقوم بمسح الكمية الزائدة التي يتم طردها باستخدام منديل كيميائي. بعد شطف الأجهزة، نرفعها ونضعها على لوح تسخين مضبوط على درجة حرارة 100 °C، ونترك الإيثانول الموجود بداخلها يتبخر، مما يساعد في تفعيل سطح السيليل.

بمجرد تجفيف الجهاز، يمكن تخزينه في مجفف لعدة أشهر، أو يمكنك أخذ الجهاز والانتقال فوراً إلى الخطوة التالية. بعد معالجة الأجهزة، تكون قد اكتسبت طبقة من السيلان على كل من سطح الزجاج وسطح PDMS. السيلان المستخدم هو capto silane يحتوي على مجموعة thiol، والتي ستتفاعل مع الرابط التشابكي ثنائي الوظيفة المتباين، وهو GMBS.

يتم تخفيفه في الإيثانول النقي. وهو يتفاعل مع الماء، لذا يجب الحرص على عدم تعريضه لظروف مائية. نقوم بحقنه في الأجهزة ونزيل أي فقاعات هواء باستخدام الملاقط كما أفعل هنا للتأكد من أن جميع الأسطح مغطاة بهذا الجزيء.

نقوم بتغطيتها ونتركها تتفاعل لمدة نصف ساعة. وبعد تفاعل GMBS لمدة نصف ساعة، سنقوم بغسل الأجهزة بالماء منزوع الأيونات لإزالة أي آثار للإيثانول الموجودة في الجهاز. ومن ثم سنقوم بتمرير Neutravidin، وهو بروتين رابط للبيوتين.

يتم بعد ذلك تخفيف الـ neutravain مسبقاً ليصل إلى تركيز 10 micrograms/mL. وإذا حُقن أي هواء عن طريق الخطأ في الجهاز، فسيتعين إعادة غسل الجهاز باستخدام الإيثانول لإزالة كافة الفقاعات الهوائية بفعالية؛ حيث يقوم الإيثانول بترطيب أسطح الجهاز بشكل أفضل، مما يسمح بإزالة أي فقاعات هواء قد تكون دخلت إلى الجهاز عن طريق الخطأ. وبمجرد غسل الأجهزة بالماء المتأين، سنقوم عادةً بملء الجهاز بما يعادل ضعفي إلى أربعة أضعاف حجم الجهاز من محلول neutravain المخفف.

سيتفاعل الـ Nutt travain مع الـ GMBS، الذي يتم تثبيته على السطح من خلال أي وسيلة أولية موجودة على الـ Nutt travain. يمكن أن تحدث هذه العملية في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. وعادةً، أقوم بوضع الأجهزة في الغرفة الباردة عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل.

ومع ذلك، قبل إضافة الجسم المضاد، نرغب في غسل أي Aden غير مرتبط في المحلول. ونقوم بذلك عن طريق تمرير محلول BSA بتركيز 1% مخفف في PBS. ونظرًا لأن هذه الرقاقات ستُستخدم في التحليلات الجينومية اللاحقة، فإن جميع المحاليل التي نستخدمها خالية من RNA.

عادةً ما نقوم بشطف الجهاز بأربعة إلى خمسة أحجام من محلول 1%BSA. وبعد ذلك، نقوم بإضافة الجسم المضاد. الجسم المضاد المستخدم في هذه التجربة هو CD 66 B، وهي أجسام مضادة متخصصة في الخلايا المحببة في الدم الكامل.

نستخدم تركيزاً يتراوح من 10 إلى 25 µg/mL، ثم نقوم بحقن الأجسام المضادة. سنحقن 200 µL من الأجسام المضادة في كل جهاز، وذلك عن طريق إجراء عمليتي حقن، سعة كل منهما 100 µL، واحدة في كل منفذ من منافذ الجهاز.

عادةً، سنقوم بحقن 100 µL في أحد المنافذ، ثم ننتظر لمدة 30 دقيقة، ونحقن 100 µL إضافية في المنفذ المقابل.