القبض على خلية باستخدام جهاز ميكروفلويديك

يتم تعبئة الأجهزة كما جهزناها في مجموعات تحتوي على 10 أو 20 قطعة، وعند وصولها، تُشحن مبردة داخل صندوق، وتحتوي المجموعة على جميع المكونات اللازمة لإجراء التجربة. تشمل المجموعة عبوة تحتوي على جميع المحاقن والمحاليل المنظمة، والتي يمكن أن تبقى في درجة حرارة الغرفة. كما توجد نسخة من البروتوكول الذي سنتبعه في هذه التجربة.

يوجد أيضاً صندوق مبرد، يحتوي على الأجهزة الفعلية وجميع محاليل التشغيل التي تتطلب التبريد. وعادةً ما يتم تعبئة المجموعات في مجموعات من 10 أو 20. ويجب حفظ هذه المجموعات في الثلاجة عند عدم استخدامها.

يتم وضع ملصق تعريفي بعناية على كل محقنة وكل مكون من مكونات الطقم، وتتوافق هذه الملصقات مع الجدول الوارد في البروتوكول الذي نتبعه؛ لذا لا يوجد أي غموض بشأن المحقنة أو مكون الطقم الذي يجب استخدامه في الخطوات الفردية. بعد تفريغ الأجهزة ووضعها داخل كابينة السلامة البيولوجية، سنقوم بتنفيذ إجراء عزل الخلايا المتعادلة (neutrophils) وتحللها من أجل تطبيقات جينومية لاحقة، وذلك لأن المستخلص الخلوي الذي سنحصل عليه سيُستخدم في العزل، أو سنقوم باستخلاص الـ RNA من ناتِج تحلل الخلايا.

بسبب ذلك، نريد التأكد من أن منطقتنا نظيفة، ليس فقط بالمعنى التعقيمي، بل ونظيفة أيضاً من أي RNAs الموجودة عادةً في البيئة. لذا من المهم جداً مسح كافة منطقتك وأجهزتك بالمحلول الذي يعمل على تدمير RNAs. وعادةً ما نقوم بمسح جميع أدواتنا وأسطح العمل لدينا باستخدام RNA SAP أو RNAs away، والتي يمكنك الحصول عليها من عدد من الشركات المصنعة.

يأتي الجهاز مغلفاً في كيس مختوم حرارياً. يتم ختم كل جهاز ووضع رمز شريطي (barcode) عليه. يجب عليك تدوين هذا الرمز الشريطي إذا كنت تعمل مع أي عينات سريرية.

إذًا، يتم فتح الجهاز، وإزالة الغطاء، ثم وضعه في جهاز مجمع تثبيت المضخة. عينة الدم التي نستخدمها هي عينة من الدم الكامل. وسنقوم بتمريرها عبر حقنة BD قياسية سعة 1 mL، وهذه الحقنة مُصنفة كحقنة رقم 1.

عادةً ما يتم إخراج المحقنة من العبوة وإزالة الغطاء بعناية من أنبوب الدم. ثم يتم سحب 700 µL أو 0.7 mL من الدم وحقن نصف هذه الكمية، أي 350 µL، في أنبوب سعة 1.5 mL. وبهذه الطريقة، يمكن تمرير الدم لإجراء المزيد من المعالجة.

يمكن تمرير أنبوب الدم الخاص بك، ومع ذلك سيظل لديك المزيد من الدم المتبقي في حالة حدوث عطل في الجهاز. والآن، سنقوم بتركيب المحقنة التي تحتوي على الدم على هذه الإبرة، المتصلة بقطعة من الأنابيب مع هذا الجهاز. يجب أن نكون حذرين للغاية مع جهاز العزل الموائع الدقيقة (microfluidic isolation device).

يجب أن نكون حذرين للغاية لتجنب إدخال أي فقاعات هوائية في الجهاز، وإلا فسوف يتعطل الجهاز. لذا، فإن ما نفعله عادةً هو أخذ المحقنة والضغط على المكبس وإضافة السائل إلى السطح العلوي للجهاز، مع التأكد من ترطيبه بالكامل قبل تفريغ كل السائل. ثم نتوقف ونزيل جسم المحقنة بعناية من الإبرة، ونقوم بملء طرف الإبرة، أو موصل لور الخاص بالإبرة، بما تبقى من المحلول المنظم في هذه المحقنة.

نقوم بالتخلص من ذلك. بعد ذلك، سنأخذ المحقنة التي تحتوي على الدم ونقوم بإدخالها في صرة التوصيل هذه، مع الحرص على عدم سكب الدم وتجنب إدخال أي فقاعات هوائية.

يُفضل استخدام مناديل ورقية (Kimo) للإمساك بجسم المحقنة والأنابيب في حالة انسكاب أي دم. وبمجرد توصيل المحقنة بمبيت الأنابيب أو بالإبرة، نقوم بالنقر عليها بضع نقرات حادة لإزالة أي فقاعات هواء قد تكون موجودة عند الموصل. بعد ذلك، يتم وضع هذه المحقنة على مضخة المحاقن ثم يتم تثبيتها باستخدام برغي القفل.

يتم تشغيل مضخة السرنجة، وهي مضبوطة مسبقاً بالفعل على ظروف التدفق الخاصة بنا. سنقوم بتدفق هذا الدم عبر الجهاز بمعدل 30 microliters في الدقيقة. وبمجرد تحميل جسم السرنجة في مضخة السرنجة، سنضغط على الزر الموجود في ذراع المكبس المتحركة ونقوم بتمريرها لأسفل حتى تلامس الجزء العلوي من المكبس وتبدأ في دفع السائل للخارج عبر الطرف.

هذه إبرة من الفولاذ المقاوم للصدأ ذات طرف غير مدبب. وبمجرد التأكد من تحضير النظام، سنضغط على زر التشغيل. ولبدء تدفق الدم، تضغط على زر الإيقاف لإنهاء التدفق، ثم تأخذ أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 1.5 mil أو أنبوب fendor، ونقوم بفصله بعناية.

افصل واحداً فقط، حيث يتم فصل الأنبوب من أحد منافذ الجهاز. وبمجرد فصل هذا الأنبوب، سنقوم بإدخاله في أنبوب فندور سعة 1.5 mil. سنقوم بالضغط على زر التشغيل (run) لبدء تدفق الدم مرة أخرى.

وعندما نلاحظ تكون قطرة من الدم، نقوم بإيقاف المضخة وإدخالها في المدخل الذي فتحناه للتو في الجهاز. سنضغط على زر التشغيل لبدء تدفق الدم، وسنضبط مؤقتاً لمدة خمس دقائق. نريد التأكد من أن الدم يملأ جميع الحجرات بالتساوي ومن عدم وجود فقاعات هواء واضحة في الجهاز.

إذا كانت هناك فقاعات هوائية تعيق التدفق إلى أي من الغرف، يمكنك استخدام ملقط وتمريره على طول القنوات الصغيرة التي تؤدي إلى غرف الالتقاط أو القنوات الصغيرة التي تخرج منها. يتم ملء هذا الجهاز بشكل جيد، لذا بعد مرور خمس دقائق، تضغط على زر الإيقاف في مضخة السرنجة لوقف تدفق الدم، ثم ترخي مشبك السرنجة وتخرجها من حامل مضخة السرنجة. بعد ذلك، سنستخدم السرنجة رقم 3، والمحملة بمحلول PBS الخالي من النوكلييز. سنقوم أساساً، مرة أخرى، بالتأكد من أن سطح الجهاز مبلل لتجنب وجود أي فقاعات هوائية، وسنقوم بالنقر على السرنجة للتأكد من وجود أي فقاعات هوائية في الجزء العلوي من جسم السرنجة.

قم بفك الذراع الموجود على مضخة السرنجة وأدخل سرنجة سعة ثلاثة مل في المضخة. أحكم ربطها، ثم ادفع المكبس لأسفل حتى يلامس مكبس السرنجة. نقوم بتشغيل الجهاز وننتظر حتى يملأ السائل الجهاز، وننتظر ظهور قطرة عند طرف الإبرة المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ.

عندما تلاحظ تكون قطرة، قم بإيقاف المضخة. سنقوم بإزالة طرف الفولاذ المقاوم للصدأ الذي يحتوي على الدم، ثم سنقوم بإدخال محلول الغسيل والضغط على زر التشغيل.

سنترك هذه العملية تستمر لمدة خمس دقائق. ويجب عليك استخدام منديل نظيف لمسح أي كمية صغيرة من الدم قد تكون موجودة عند المدخل أو المخرج. بعد تشغيل محلول الغسل عبر الجهاز لمدة خمس دقائق، يجب أن يكون الجهاز خالياً تماماً من أي دم، ويمكنك التحقق من ذلك من خلال ملاحظة عدم وجود أي دم أحمر متبقٍ في الجهاز، حيث سيبدو الجهاز شفافاً. لذا، ما سنقوم به هو إيقاف تدفق محلول الغسل بعد مرور الخمس دقائق.

ومرة أخرى، سنقوم بنزع المحقنة من مضخة المحاقن. سنقوم بإغلاق أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 ml، مباشرة على أنبوب المخرج المرن. ثم سنرفع أنبوب الطرد المركزي الدقيق بعناية، مع سحب أنبوب النفايات من الجهاز.

سوف نتخلص من ذلك في حاوية النفايات البيولوجية الخطرة. تشتمل المجموعة على أنبوب مخرج جديد، وهو مصنوع في الواقع من مادة Teflon. ويحتوي هذا الأنبوب أيضاً على طرف من الفولاذ المقاوم للصدأ.

سنقوم باستبدال أنبوب المخرج القديم بأنبوب المخرج الجديد هذا. سنأخذ أنبوب المخرج هذا ونحاول ثنيه ليشكل ما يشبه حرف U أو V. كما تتضمن المجموعة عمود تفتيت من نوع kaya، والذي يعمل على قص DNA وتجنيس العينة الخلوية بشكل أساسي.

سنقوم بفتح الغطاء الأرجواني لعمود التقطيع ووضع أنبوب المخرج في عمود Kay Shredder. سنأخذ من المجموعة المحقنة رقم 2، المخصصة لـ RLT. وهي محقنة BD قياسية بسعة 1 mil مع طرف غير مدبب مقاس 22 gauge من الفولاذ المقاوم للصدأ.

سنستخدم ذلك لحقن 350 µL من محلول RLT القياسي من شركة kyogen في الجهاز. وبما أن الجهاز يحتوي على حجم ميت يبلغ حوالي 50 µL، فإن ما نرغب في فعله هو حقن RLT، ولكن خلف الـ RLT، نريد حقن سدادة من الهواء لدفع ذلك الحجم الميت من الجهاز إلى عمود التقطيع chi shredder. والطريقة التي سنقوم بها بذلك هي عبر استخدام المحقنة، حيث سنسحب 350 µL من الهواء، يليه 350 µL أو 0.35 mL من RLT، وبذلك يصبح RLT الآن في أسفل المحقنة.

قاوم الرغبة في قلب المحقنة وحقن الهواء؛ فوجود الهواء يضمن نقل كامل كمية RLT إلى عمود Kay shredder. سنقوم الآن بسحب الأنبوب المتصل بمحلول الغسيل.

سنقوم بإدخال المحقنة التي تحتوي على RLT وحقنه ببطء في الجهاز على مدار 30 ثانية تقريباً، مع التأكد من أن أنبوب المخرج يقوم بتصريف النفايات في عمود Kay Shredder. وبمجرد أن يبدأ الهواء في الدخول إلى الجهاز، اضغط على المكبس وانتظر حتى يتم تفريغ كل السوائل في عمود Kay Shredder. بعد ذلك، نقوم بإزالة عمود Kay Shredder وطرد مركزه باستخدام جهاز طرد مركزي دقيق (microcentrifuge) متوازن بسرعة 15,000 RPM أو بأقصى سرعة دوران لجهاز الطرد المركزي الدقيق المكتبي لمدة دقيقتين.

بعد طرد العمود مركزياً لمدة دقيقتين، سنقوم بإخراج العينة منه، والتي أصبحت الآن في محلول RLT، وسنضعها في إحدى أنابيب الحفظ بالتجميد ذات الغطاء الأرجواني المرفقة. إذا كنت تعمل مع عينة سريرية، فستقوم بتسمية أنابيب الحفظ بالتجميد هذه في بداية التجربة. هذا هو المُحلل في أنبوب الحفظ بالتجميد.

توضع هذه الأنبوبة المبردة فوراً في مجمد بدرجة حرارة -80 °C وتُخزن للشحن أو لاستخلاص RNA لاحقاً. هذا بروتوكول بديل لعزل الخلايا المتعادلة؛ فبدلاً من تحليل الخلايا باستخدام محلول RLT المنظم، سنقوم بصبغها بصبغة نسيجية قياسية.

صبغة. لذا نقوم بإخراج الجهاز المختوم من الكيس ونفتحه مرة أخرى، ونسجل رقم التشغيلة الموجود على الجهاز ونضع طبق بتري في حامل أطباق بتري.

سنأخذ المحقنة سعة 1 مل من كيسها، المحقنة رقم 1، ونملؤها بـ 700 µL من الدم، ثم نحقن نصف هذه الكمية، أي 350 µL، في أنبوب eend DPH. سنضع هذا الأنبوب جانباً. ثم نأخذ المحقنة رقم 4، المزودة بالأنابيب التي سنستخدمها للحقن، ونحقن الدم في الجهاز.

سأقوم بإمساك قاعدة الإبرة من طرف الأنبوب بطريقة كيميائية. قم بإزالة جسم المحقنة وملء الوصلة. سيقوم المحول بتنظيم والتخلص من تلك المحقنة.

سنقوم بإدخال المحقنة التي تحتوي على الدم في الإبرة باستخدام منديل كيميائي (chem wipe) لتجميع أي تسرب. سنقوم بالنقر على المحقنة لإزالة أي فقاعات هوائية عند نقطة الاتصال بين الإبرة وجسم المحقنة. سنضع المحقنة في مضخة المحاقن، ثم نقوم بتجهيز الأنابيب عن طريق الضغط لأسفل على الذراع المتحركة لمضخة المحاقن.

سنقوم بفصل الأنبوب من إحدى فتحات الجهاز، وهو جهاز الالتقاط، ووضعه في أنبوب إينور سعة 1.5 مل. وبعد ذلك، سنبدأ بتدفق الدم عن طريق الضغط على أمر التشغيل (run) في مضخة السرنجة. وسننتظر حتى تتكون قطرة من الدم عند الطرف المصنوع من الفولاذ المقاوم للصدأ.

بمجرد تكوّن القطرة، اضغط على إيقاف (stop) وامسح تلك الدماء، ثم أدخلها في الجهاز واضغط على تشغيل (run). الآن نضبط المؤقت لمدة خمس دقائق. حسناً، بعد التدفق عبر الجهاز لمدة خمس دقائق، اضغط على إيقاف (stop) في مضخة السرنجة وقم بتحرير السرنجة.

وسنقوم باستبدال تلك المحقنة بمحقنة سعة 3 mL تحتوي على محلول الغسيل المنظم، وهو عبارة عن 1×PBS. ومرة أخرى، نريد التأكد من أن الجزء العلوي من الجهاز مُحكم الإغلاق، ومن ثم سنقوم بإزالة طرف الإبرة الذي يحتوي على الدم أو الـ run+. ابدأ بعملية تحضير الجهاز.

عندما تتشكل القطيرات، نقوم بإدخالها في الجهاز والضغط على زر التشغيل، ثم نقوم بمسح أي دم موجود عند أنبوب الإدخال أو أنبوب الخروج، ونترك السائل يتدفق لمدة خمس دقائق بعد خطوة الغسيل. مرة أخرى، سنوقف مضخة الحقنة ونزيل الحقنة من حامل المضخة. ولإجراء صبغ GIM القياسي، سنقوم أولاً بتثبيت الخلايا وتجفيفها باستخدام 100% methanol.

لذا، لدينا محقنة سعة 3 مل محملة مسبقاً بالميثانول. مجدداً، سنقوم بتحضير المحقنة للتأكد من تدفق الميثانول، ثم نوقف مضخة المحقنة، وندخلها في الجهاز، ونضغط على زر التشغيل. سنقوم بتثبيتها في محلول الميثانول هذا لمدة تتراوح من دقيقتين إلى أربع دقائق.

بعد مرور دقيقتين إلى أربع دقائق من التثبيت والميثانول، نقوم بإيقاف المضخة، وتفريغ المحقنة من الميثانول، وهنا سنقوم بتعبئة محقنة سعة 3 مل تحتوي على صبغة eem sustain القياسية من شركة Sigma مخففة بنسبة 1 إلى 5 في ماء منزوع الأيونات. وبعد التخفيف، قمنا بتعبئتها في المحقنة، وفي نهاية المحقنة نقوم بتوصيل مرشح بمقاس 0.8 ميكرون لترشيح أي جسيمات قد تؤدي إلى انسداد الجهاز. تترك العينة لتصبغ لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق.

وبعد ذلك، سنقوم بالشطف باستخدام الماء منزوع الأيونات. لذا، بعد الصبغ لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق، سنوقف مضخة المحقنة ونقوم باستبدال المحقنة التي تحتوي على محلول الصبغ بمحقنة تحتوي على الماء منزوع الأيونات، حيث سنقوم بعملية الغسل حتى نلاحظ زوال اللون الأزرق لصبغة SAI من الجهاز. وبمجرد شطف فائض صبغة gim sustain من الجهاز، نوقف تدفق محلول الغسل.

بعد ذلك، سنقوم بإزالة حقنة الماء من المدخل. ثم سنأخذ أنبوب المخرج الخاص بالجهاز، ونمسك نهاية هذا الأنبوب باستخدام الملاقط.

هذا أنبوب tigon مرن وسوف نقوم بإدخاله مرة أخرى في مدخل الجهاز. يعمل ذلك على إحكام إغلاق الجهاز والحفاظ على رطوبة الخلايا وسلامة شكلها المورفولوجي. الآن سيقوم زميلي، الدكتور John Hong Chang، بعرض بروتوكول بديل لعزل الخلايا اللمفاوية CD4 positive، يليه صبغ مناعي فلوري مباشرة داخل الجهاز الموائع الدقيقة.

اسمي شونغ هونغ، وسأقوم اليوم بتوضيح عملية صبغ الخلايا في جهاز مائعيات دقيقة. في هذه المرحلة، تم بالفعل توضيح كيفية استخدام جهاز عزل مناعي مائع دقيق لعزل خلايا الدم بشكل محدد من دم كامل غير معالج. ولتحقيق هذا الغرض، يرغب المستخدم في تحليل الخلايا واستخلاص محتوى البروتين وDNA من تلك الخلايا المعزولة. أما بالنسبة لأبحاثي، فأنا مهتم بالحصول على الخلايا ثم إجراء تعداد خلوي، على سبيل المثال، للحصول على تعداد خلايا CD4 من الدم الكامل، واستخدام ذلك كمؤشر لأغراض تشخيصية.

لذا فإن الجهاز المستخدم مشابه جداً لجهاز كين؛ حيث يتكون من غرفة مستقيمة مصنوعة من P-D-M-S. تختلف الهندسة قليلاً، لذا فإن معاملات التشغيل تختلف بشكل طفيف، بينما تظل إجراءات التشغيل العامة متشابهة جداً بشكل عام.

لذلك، سأتجاوز جميع خطوات التقاط الخلايا والشطف، وسأنتقل مباشرة إلى خطوة صبغ الخلايا في إجراءات عد الخلايا. لدي هنا جهاز تم فيه بالفعل التقاط نصف الخلايا من دم كامل، وتم شطف الجهاز مسبقاً باستخدام PBS. وبذلك تكون الخلايا غير المرغوب فيها قد غُسلت بالفعل من الجهاز، وقد قمت مسبقاً بتحضير خليط من الأجسام المضادة يُستخدم خصيصاً لوسم الخلايا المعزولة داخل الجهاز.

لقد تم تحسين تركيز الأجسام المضادة المستخدم هنا من أجل صبغ الخلايا بكثافة فلورية عالية جداً تحت المجهر الفلوري. لذا فإن الإجراء بسيط ومباشر؛ حيث نقوم بتحميل المحقنة المملوءة بمحلول الأجسام المضادة على مضخة المحاقن، ثم نتأكد من ضبط معدل التدفق وفقاً للمعايير الصحيحة المطلوبة.

وبعد ذلك سنقوم بتشغيل مضخة الحقنة، ومراقبة طرف الأنبوب، والتأكد من خروج المحلول بالفعل بحيث لا تتبقى أي فقاعات داخل الأنبوب. ومن ثم يمكننا توصيل الأنبوب بالجهاز الموائع الدقيقة الذي تم اصطياد الخلايا بداخله. والآن يتدفق الجسم المضاد إلى الجهاز لصبغ الخلايا التي عزلناها داخل الجهاز؛ أما معدل التدفق هنا، فأنا أستخدم 5 µL/min، ولكن بناءً على هندسة الجهاز، قد تكون هناك بارامترات تدفق مختلفة ترغب في استخدامها لغرضك.

وسنقوم بتدفق محلول الأجسام المضادة لمدة خمس دقائق، وهي مدة كافية لضخ حجم يحل محل كافة المحاليل الموجودة داخل القناة الميكروية. لذا، سنقوم بإيقاف التدفق بعد حقن الأجسام المضادة. وبذلك، يتم تدفق الأجسام المضادة بمعدل 5 µL/min لمدة خمس دقائق لاستبدال جميع المحاليل داخل القناة الميكروية.

بعد ذلك، نقوم بإيقاف التدفق ونترك الجهاز ليتخضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. ويجب القيام بهذه العملية في الظلام حتى لا تخمد الأجسام المضادة، إذ يمكن أن تخمد الأجسام المضادة الفلورية أثناء تخضن الخلايا مع جسم مضاد صابغ. لذا، بعد الصبغ لمدة تتراوح عادةً بين 15 دقيقة إلى 30 دقيقة، نقوم بفصل الأنابيب من الجهاز واستبدال سرنجة الجسم المضاد بسرنجة محلول منظم لغسل الأجسام المضادة غير المرتبطة من الجهاز.

يحتوي محلول الغسيل هنا على 1%BSA في محلول PBS. يُستخدم BSA لمنع الارتباط غير النوعي للأجسام المضادة على السطح وسنقوم بفعل الشيء نفسه. لذا، نقوم أولاً بضبط معدل التدفق في مضخة السرنجة للتأكد من أنه معدل التدفق الصحيح المطلوب، ثم نبدأ بتشغيل مضخة السرنجة والتأكد من خروج السائل بالفعل من الأنبوب قبل توصيله بالجهاز.

الغرض من القيام بذلك هو ضمان عدم بقاء أي فقاعات هواء عالقة في الأنابيب، وبذلك لا تدخل أي فقاعة إلى الجهاز عند الحقن. لذا، نقوم ببساطة بتوصيل الأنبوب بالجهاز ونتركه يتدفق لمدة خمس دقائق أخرى لاستبدال كافة سوائل الغسيل وإزالة جميع الأجسام المضادة غير المرتبطة من الجهاز.

بعد خطوة الغسيل، سنقوم بتثبيت الخلايا باستخدام 1% PFA. والغرض من القيام بذلك هو إمكانية تخزين الجهاز لبضعة أسابيع في حال تعذر إجراء التصوير على الفور. لذا فإن الإجراء مباشر للغاية.

هذه العملية مشابهة لما قمنا به سابقاً؛ حيث نقوم بتحميل المحقنة على المضخة، وضبط معدل التدفق إلى القيمة المطلوبة، ثم نشغل مضخة المحقنة ونوصل الأنبوب بجهازنا لحقن محلول paraform IDE، وهو المادة المثبتة، داخل الجهاز لتثبيت الخلايا. ومرة أخرى، نترك المحلول يتدفق لمدة خمس دقائق تقريباً.

وبذلك، يحل الـ PFA محل جميع المحاليل المنظمة في الجهاز لتثبيت كافة الخلايا الموجودة بداخله. لذا، بعد خطوة التثبيت باستخدام الـ PFA، نقوم ببساطة بإزالة حقنة الـ PFA، ويصبح الجهاز الآن جاهزاً للتصوير. وفي بعض الحالات، يرغب الباحثون في إجراء صبغ للنواة لعرضها كطبقة متراكبة مع صبغ مؤشرات سطح الخلية.

لذلك، وبهذا الغرض، سنقوم بصبغ النوى باستخدام DPI في النهاية. لذا، نقوم بتحميل سرنجة DPI، ثم نشغل مضخة السرنجات لتدفق DPI داخل جهازنا. وبذلك، سيتم صبغ النوى في تلك الخلايا لتوضيح موقعها.

ويمكن لاحقاً دمج صورة صبغ DPI مع صبغ المؤشرات السطحية لتوضيح مواقع الخلايا. لذا، في نهاية عملية صبغ DPI، نحتاج إلى غسل DPI غير المرتبط مرة أخرى باستخدام محلول منظم. ومرة أخرى، نستخدم PBS يحتوي على 1% BSA لغسل DPI غير المرتبط.

وتشبه هذه العملية ما قمنا به سابقاً؛ حيث نقوم فقط بتوصيل محقنة المحلول المنظم بالجهاز، ونترك المحلول يتدفق داخل الجهاز لغسل الـ dap غير المرتبط. وبهذا تكتمل إجراءات صبغ الخلايا في جهاز الموائع الدقيقة.

وبعد الانتهاء من كافة إجراءات الصبغ، تصبح الأجهزة جاهزة للتصوير. ونظرًا لأننا أجرينا التثبيت باستخدام PFA، يمكن أيضًا تخزين الأجهزة لبضع أسابيع في حال تعذر إجراء التصوير على الفور.