جهاز ميكروفلويديك مع أنماط Groove لدراسة السلوك الخليوي

اسمي جيانغ، وأنا زميل ملصقات بحثية في جامعة هارفارد ومعهد ماساتشوستس للتكنولوجيا، في تخصص الصحة والعلوم والتكنولوجيا. وتتمثل خبرتي في هذا المختبر في القدرة على ابتكار أجهزة ميكروفلويديك (microfluidic) جديدة لدراسة السلوك الخلوي. حيث يمكنني ابتكار أجهزة تدرج ميكروفلويديك مبتكرة للغاية، كما يمكنني أيضاً ابتكار أجهزة ميكروفلويديك متكاملة.

يمكن لجهاز TC التحكم بدقة في التفاعلات بين الخلايا، وكذلك في تلامس الخلايا مع العوامل الشمسية. لذا، باستخدام نظام TC، يمكنني الدراسة لفهم البيولوجيا الخلوية الأساسية، بالإضافة إلى تطبيق بعض مبادئ بيولوجيا النمو، وبعض مجالات الهندسة الحيوية للخلايا الجذعية. اسمي أمير مانشي، وأنا طالب في مرحلة البكالوريوس في مختبر البروفيسور هان بقسم العلوم والتكنولوجيا الصحية في جامعة هارفارد ومعهد ماساتشوستس للتكنولوجيا (MIT).

لقد كنت أعمل على أجهزة الموائع الدقيقة، وقد حاولنا تقديم إثبات للمبدأ يظهر أن أجهزة الموائع الدقيقة تمتلك إمكانات كبيرة لاستزراع الخلايا وإجراء دراسات مختلفة مثل دراسات السُمية، كما حاولنا دراسة وتحسين خصائص السوائل داخل هذه الأجهزة كدالة لمعدلات التدفق والهندسة وغيرها من المعايير المختلفة. نبدأ الآن من غرفة التصنيع الدقيق، وما سنقوم به هو محاولة صنع بعض أجهزة الموائع الدقيقة؛ ولكي نتمكن من تنفيذ هذه الأجهزة، نحتاج إلى أنماط من رقائق السيليكون وقوالب PDMS فوقها. وبوليمر PDMS هذا هو في الواقع خليط من مادتين مختلفتين.

عبارة عن خليط من مادة السيليكون المرنة الأساسية وعامل معالجة السيليكون المرن. وتتم عملية خلط هذين المكونين بنسبة 10 إلى 1، بحيث نستخدم 10 أجزاء من المادة الأساسية وجزء واحد من عامل المعالجة. الآن، أحتاج إلى حوالي 20 gram من المادة الأساسية هنا.

أحتاج أيضاً إلى جرامين من عامل المعالجة، علماً بأن عامل المعالجة أقل كثافة بكثير. لذا سيتدفق بشكل أسرع ويجب أن أكون حذراً قليلاً. الساعة الآن حوالي 22 وأريد خلط القاعدة مع عامل المعالجة معاً.

لذلك سأستخدم الماصة للقيام بذلك. سأحاول خلط المكونات معاً بشكل جيد قدر الإمكان. أريد صب بوليمر PDMS هذا فوق رقاقات السيليكون التي تحتوي بالفعل على أنماط في الأعلى، حيث تساعد رقاقة السيليكون في إعطاء النمط لقوالب PDMS.

يمكنكم ملاحظة أن لدي رقاقتين من السيليكون هنا، والسبب في ذلك هو أن إحداهما مخصصة للطبقة العلوية من جهاز الموائع الدقيقة الخاص بنا، والأخرى مخصصة للطبقة السفلية. نحن بحاجة إلى طبقتين في أجهزة الموائع الدقيقة لأننا نسعى لتكوين قناة بالداخل، والفكرة الأساسية من أجهزة الموائع الدقيقة هي رغبتنا في إيجاد تدفق داخل تلك القنوات. لذا، أحتاج إلى سكب هذا الخليط فوق كلتا رقاقتي السيليكون لوجود الكثير من الفقاعات داخل هذا الخليط.

أرغب في إزالة هذه الفقاعات، وللقيام بذلك نستخدم تفريغ الهواء لإخراج تلك الفقاعات. لقد عدنا الآن إلى منطقة المختبر الرئيسية، وكما أخبرتكم مسبقاً، نظراً لوجود الكثير من الفقاعات داخل خليط PDMS، فإننا نرغب في إزالتها؛ لذا سأضع الخلائط فوق رقائق السيليكون داخل غرفة التفريغ. سأقوم بإغلاق الغرفة وتشغيل جهاز التفريغ، وبعد الانتهاء من ذلك، سنضع قوالب PDMS داخل الفرن طوال الليل لجعلها أكثر صلابة.

حسناً، نحن الآن في المختبر ونريد تجميع هذه الأجهزة الموائع الدقيقة. ما سنقوم به هو أخذ قوالب PDMS، التي كانت موجودة داخل الحاضنة طوال الليل وقد تشكلت فيها الأنماط التي كانت موجودة على رقائق السيليكون، وسأستخدم نمطين مختلفين. يمكنك رؤية القناة الدقيقة على الجانب الأيسر، والتي ستكون الطبقة العلوية، ويمكنك رؤية بعض أنماط الخطوط الخضراء على الجانب الأيمن، والتي ستكون الطبقة السفلية.

وهذا سيشكل الأخاديد داخل الجهاز الدقيق. سأبدأ بقص هذه الهلامات لكي تنفصل الطبقة العلوية بسهولة عن رقاقة السيليكون. وما سأفعله هو نقلها إلى أطباق بتري هذه بحيث يكون الوجه للأعلى، لكي تكون الأنماط متجهة للأعلى.

وسأقوم بتجربة الأمر ذاته بالنسبة للأخاديد، والتي كانت عبارة عن أنماط الخطوط الخضراء. لذا ستشكل هذه الطبقة السفلية. وبمجرد قطع الهلام، سأقوم بنقله إلى طبق بيتري، ومن أجل منع تراكم الغبار فوق الأنماط، سأقوم بتغطيتها بشريط لاصق.

الخطوة التالية هي ثقب نهايات القنوات للسماح بتدفق الخلايا والوسط الغذائي من وإلى الداخل. وبسبب وجود سطح واسع هنا وعدم قدرتي على رؤية الأنماط بنفسي، سأستخدم هذه الأداة لأتمكن من رؤية القنوات ومن ثم ثقب كلتا النهايتين. لذا، سأقوم بعمل ثقب كبير هنا لضمان وجود احتياطي، وفي الجانب الآخر سأقوم بعمل ثقب صغير لأتمكن من استخدام أنابيب poly ethanol في تلك الجهة.

نحن الآن في غرفة التصنيع الدقيق، والخطوة التالية هي لصق السطحين المختلفين اللذين لدينا. وللقيام بذلك، سنستخدم هذه الآلة التي تسمى منظف البلازما (plasma cleaner)، وتسمى هذه العملية معالجة بالبلازما. ما يحدث داخل هذه الغرفة هو خلق بيئة بلازمية، وعند حدوث التفاعل بين البلازما والسطح، ستقوم البلازما بتكسير الروابط السطحية الضعيفة واستبدالها بمجموعات كيميائية عالية التفاعل.

الآن، سأقوم بإزالة الأشرطة اللاصقة التي وُضعت هنا لمنع دخول الغبار، ثم سأضع هذه القوالب داخل الغرفة. سأغلق هذا الباب تماماً، ثم أقوم بتشغيل الطاقة أولاً وبعد ذلك المضخة، وبذلك نكون مستعدين للبدء. سنتابع العملية بعد خمس إلى 10 دقائق.

الآن أريد إيقاف التشغيل، لذا سأقوم بإيقاف تشغيل المضخة والطاقة، ومن ثم سأفتح الغرفة. في الواقع، يوجد ضغط سلبي هنا، لذا قد تسمعون صوتاً؛ وذلك بسبب الضغط السلبي، لذا سأقوم بإخراج القوالب ببطء.

بما أن كلا السطحين ذوي الأنماط متجهان للأعلى، سآخذ الطبقة السفلية وأضعها في يدي اليسرى، ثم سآخذ الطبقة العلوية وأقلبها وأضعها فوق الأخاديد، وبعد ذلك سأضغط الطبقتين فوق بعضهما البعض. إن قوة الالتصاق وديمومته هما الميزة الأساسية لاستخدام جهاز المعالجة بالبلازما هذا. وما تلاحظونه هنا الآن هو أنه يمكنكم رؤية القناة في الطبقة العلوية والأنماط المحززة في الطبقة السفلية، وهي الآن جاهزة للانتقال إلى الخطوة التالية.

ثم نأتي بغرفة الزرع هذه، وغذاء الزرع، ونفتح غطاء الطبق. بعد ذلك، يمكننا تحميل الفبرونكتين، حيث نسحب 60 µL من الفبرونكتين ثم نحمله داخل الجهاز. ومن أجل توليد تدفق داخل الجهاز لتحفيز عملية التغطية الصغيرة للفبرونكتين داخل القناة، يمكننا ببساطة سحب الهواء بلطف من المخرج.

بعد ذلك، يمكننا وضع هذا الجهاز في الحاضنة لمدة ساعة واحدة. وبعد ساعة من التبريد والاهتزاز داخل الحاضنة، نقوم بإخراج العينة من الحاضنة، ثم نستخدم ثلاث فرشات ليفية، حيث نقوم بعملية الفصل والتشتيت، ثم نضيف الوسط الغذائي، وبعد ذلك نقوم بحساب عدد الخلايا باستخدام عداد الخلايا.

عادةً ما يكون لدينا مليون خلية مستقرة داخل الجهاز. لذا، بعد عملية التفكيك، يمكننا ببساطة دفع المحلول عدة مرات، ثم سحب معلق الخلايا وتحميله داخل القناة؛ ولتحميل الخلايا بشكل أفضل داخل القناة، يمكنك تدفقها بلطف باستخدام الشفاط.

يتم سحب الوسط العلوي والمعلق السطحي عبر مخرج الخلية بشكل تلقائي عمومًا، مما يؤدي إلى استزراع القناة العالمية الانتقائية. بعد ذلك، يمكننا ببساطة تفكيك الجهاز ووضعه في الحاضنة لمدة ساعة واحدة، وذلك حتى تنتشر الخلايا تماماً داخل القناة. ومن ثم يمكننا حقن annexin V و prop iodide بالإضافة إلى hydro peroxide.

ثم قم بدراسة مقايسة فرضية الوقت الخاصة بك. يمكننا ببساطة أخذ العينة داخل وسط زراعة الأنسجة، ومن ثم تحضير المحلول المكون من 2 mL من وسط DMEM، بالإضافة إلى 20 µL من annex five، و 40 µL من prop iodine، و 100 mL من hydrogen peroxide. وبعد ذلك، خذ وسط DMEM مع annex five و prop iodide و hydro perside، ثم ضع السرنجة بعد ذلك.

ضع وسط الميليا بمقدار 2 مل، وAnnex V Prop Iodide، وHydro Peroxide. يمكننا وضع المحلول داخل السدادات ثم إزالة الفقاعات، وبعد ذلك يتم توصيل C-bear. هذه السدادات من نوع Hamilton warm mill وهي محكمة الغلق ضد الغازات.

هذا هو الثلاثي. وهذا هو سقف مخصص للاستخدام لمرة واحدة. وهذه إبرة قياس 27 gauge.

هذا الأنبوب البلاستيكي من مادة PE 20. بعد تحميل المحلول داخل المحقنة، يمكنك ببساطة الدفع بالكامل عدة مرات، ثم النقر أحياناً على المحقنة لإزالة الفقاعات وسحب المحلول. مرة أخرى، ادفع المحلول بالكامل، وأزل الفقاعات، ثم أعد البرمجة بلطف.

لذا، خذ المحلول الخاص بوجبة واحدة ثم يمكننا تحويل الصمام. ادفع المحلول عبر الصمام ثلاثي الاتجاهات ليمر بالكامل في الأنبوب. وفي النهاية، يخرج المحلول من طرف الأنبوب، وعندها يمكننا ببساطة توصيل الأنبوب بالجهاز الدقيق وبدء التسريب بمعدل 1 µL لكل دقيقة.