تصوير مستقبلات الاستروجين في الشرايين α بيال فأر باستخدام مجهر رقمي مناعي

الهدف العام من هذا الإجراء هو وصف تقنية بسيطة لتحسين صبغ وتصور مستقبل الإستروجين ألفا باستخدام مقاطع عرضية من شرايين القشرة التي تم الحصول عليها من أدمغة إناث الجرذان. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إزالة شرايين القشرة المصبوغة بصبغة إيفانز الزرقاء من سطح الدماغ، ثم تقطيعها إلى حلقات بسمك ثمانية ميكرون باستخدام جهاز الميكروتوم التجمدي (cryostat) بعد عملية التقطيع. بعد ذلك، يتم تثبيت المقاطع العرضية على شرائح وزراعتها مع الجسم المضاد الأولي ضد مستقبل الإستروجين ألفا.

بعد ذلك، تُحضن المقاطع مع الجسم المضاد الثانوي والصبغة المضادة باستخدام أوساط تثبيت تحتوي على dpi. وفي النهاية، يتم تصوير قطاعات الأوعية الدموية للقشرة الموّسمة فلورياً وتحويلها إلى صور ثنائية الأبعاد باستخدام برنامج التركيز العميق الممتد. وفي الختام، يمكن الحصول على نتائج تظهر مستقبلات الإستروجين ألفا في شريينات القشرة من خلال استخدام مجهر Nikon المناعي الفلوري المزود ببرنامج التركيز العميق الممتد.

اسمي الدكتورة مارجريت ليتلتون كيرني. سيقوم اليوم الدكتور نيل فاراني، وهو زميل ما بعد الدكتوراه في مختبري، بشرح إجراء بسيط من أجل تحسين عملية التصوير والصبغ لمستقبل الإستروجين ألفا (estrogen receptor alpha) في القشرة.

يتم استخراج الشرايين من دماغ جرذ تم ترويته بصبغة إيفانز الزرقاء (Evan's blue) وحُفظ في درجة حرارة 70- درجة مئوية. باستخدام مجهر تشريحي، يتم تحديد الشرايين القشرية على سطح الدماغ وإزالتها باستخدام ملقط دقيق الطرف، مع الحرص على إزالة أي أنسجة دماغية ملتصقة.

ضع الشرايين في أنبوب اختبار صغير على الثلج. ثبّت الشرايين في فورمالدهايد مبرد بتركيز 2% في 0.1 mole من PBS لمدة 30 دقيقة. ولتحضير الشرايين للتقطيع، صب وسط التضمين على قرص تجميد مضبوط عند درجة حرارة -20 °C.

ضع مقطعاً من الشريان بشكل مسطح على القالب والانتظار حتى يتجمد. وبمجرد أن يتجمد بإحكام، ضع الشريان بشكل عمودي في وسط التضمين على قرص التجميد الخاص بالمجهر المبرد (cryostat). تأكد من أن طرف الشريان موجه إلى الأمام.

ثبّت الشريان باستخدام الملقط حتى يتجمد تماماً. ضع قرص التجميد الذي يحتوي على الشريان في رأس الميكروتوم المجمد (cryostat)، ثم قم بقص حلقات شريانية رقيقة بسمك ثمانية ميكرون مباشرة على شريحة. ثبّت المقاطع الشريانية على جيلاتين بوتاسيوم الكروم.

قم بتسوية الشرائح باستخدام فرشاتي طلاء لفرد الحلقات الشريانية. احفظ الشرائح المُجهزة في صندوق شرائح في الثلاجة عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل. أخرج الشرائح من الثلاجة واتركها لتصل إلى درجة حرارة الغرفة على سطح المختبر.

اغسل الشرائح باستخدام 1 إلى 1.5 ملليلتر من PBS بتركيز 0.1 مولار. بعد 10 دقائق، صرّف الـ PBS وكرر العملية مرتين إضافيتين. بعد الغسلة الأخيرة بالـ PBS، حضّن الشرائح في ملليلتر واحد من كلوريد الأمونيوم بتركيز 50 ميليمولار لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ومن أجل تقليل الفلورة الذاتية، اغسل الشرائح في PBS بتركيز 0.1 مولار 3 مرات لمدة 10 دقائق لكل غسلة كما تم وصفه سابقاً. بعد ذلك، قم بحجب الشرائح في محلول PBS يحتوي على 0.1% Triton X 100 بالإضافة إلى 1% مصل ماعز طبيعي لمدة 30 دقيقة لتقليل الارتباط غير النوعي للأجسام المضادة الأولية.

بعد عملية الحجب، تُحضن الشرائح مع الجسم المضاد الأولي ضد ER alpha المخفف بتركيز 1:500 في محلول الحجب طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. تُخرج الشرائح من الثلاجة وتُترك لتصل إلى درجة حرارة الغرفة. يُغسل أي جسم مضاد أولي غير مرتبط باستخدام 1 إلى 1.5 milliliters من 0.1% PBS ثلاث مرات لمدة 10 دقائق.

في كل مرة، يتم تحضين الشرائح مع Oregon Green, 4 88 secondary anti rabbit في محلول الحجب لمدة ساعتين في الظلام في درجة حرارة الغرفة، وبعد التحضين، تُغسل الشرائح في 0.1 molar PB S ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل غسلة، ثم تُنقل إلى غطاء محرك التهوية. ضع قطرة من وسط التثبيت الذي يحتوي على dappy على العينات، ثم ضع غطاءً زجاجياً فوق العينة. استخدم طلاء أظافر شفافاً لإغلاق حواف الغطاء الزجاجي واتركه ليجف تماماً.

ضع الشرائح المُعدة التي تحتوي على قطع الأوعية المقشرة والمصبوغة تحت المجهر، واضبط التركيز لرؤية المناطق ذات الأهمية المحددة بصبغة فلورية. وتعد عملية رؤية ER alpha المصبوغة الخطوة الأكثر صعوبة في هذا الإجراء. ابحث عن مستوى قطع الوعاء الذي تظهر فيه المستقبلات بأكبر قدر من الوضوح.

ابدأ باستخدام تكبير 100 مرة ثم زد التكبير إلى 600 مرة. استخدم الكاميرا لالتقاط صور في قناتي DPI وZI لنوى الخلايا وDR alpha على التوالي، ثم استخدم برنامجاً لتحويل طرق عرض متعددة لقطع الأوعية إلى صور ثنائية الأبعاد. هنا، تظهر نتائج صبغ المناعة الفلورية لـ ER alpha باللون الأخضر مع الصبغ المضاد بـ DPI.

في اللون الأزرق في حلقة شريان تم عزلها من دماغ جرذ أنثى، تشير الصور المدمجة إلى وجود مستقبل الإستروجين ألفا داخل النواة. من خلال استخدام مجموعة من صور Zack، يمكن الحصول على صورة مركزة للفلورة المناعية لمستقبل الإستروجين ألفا لمحاسبة الفلورة الذاتية؛ ويجب إجراء ضوابط سلبية للفلورة الذاتية لكل من الأجسام المضادة الأولية والثانوية. لاحظ الفلورة الذاتية المتميزة على طول الجانب البطاني للشريان الذي لم يتم تحضينه مع الجسم المضاد الثانوي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب معرفة بكيفية عزل وتقشير الشرايين من سطح الدماغ وإعداد حلقات مقطعية بعرض ثمانية ميكرون. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تصبح على دراية بكيفية استخدام مستقبلات الإستروجين ألفا الموصومة فلورياً، وكيفية تصوير هذه المستقبلات باستخدام مجهر التألق المناعي الرقمي وبرنامج Nikon extended.