التغييرات في هيكل رصد التوازن الحمض النووي الريبي ل 'Peroxidative' و 'مؤكسد' Footprinting الهيدروكسيل

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد كيفية انطواء جزيئات RNA باستخدام بصمة الجذور الحرة للهيدروكسيل. ويتم تحقيق ذلك من خلال وسم الطرف، والتنقية بالهلام، والطي المسبق لـ RNA، مما يضمن السلامة التشكيلية لـ RNA قبل عملية الطي بوساطة المغنيسيوم كخطوة تالية، حيث يتم خلط كواشف Fenton لتوليد جذور الهيدروكسيل، والتي يمكنها لاحقاً شطر هيكل RNA وفقاً لمدى إمكانية وصول المذيب إليه. بعد ذلك، يتم فصل نواتج شطر RNA بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد المسخ، وتتم معاينتها بواسطة التصوير الشعاعي الذاتي.

يتم تقدير كمية تكاملات النطاقات باستخدام برنامج تحليل البصمات شبه الآلي. والهدف النهائي هو إنشاء متساويات حرارة الطي التي تعكس تكوين البنية الثالثية لـ RNA. ويتم تحقيق ذلك من خلال تحويل تكاملات النطاقات المعيرة إلى تشبع كسري.

يمكن لاحقاً ملاءمة متساويات الحرارة مع معادلة هيل. تكمن الميزة الرئيسية لبصمة الهيدروكسيل في الحصول على معلومات حول البنية الثالثية لـ RNA باستخدام مواد كيميائية غير مكلفة، وذلك نظراً للنشاط العالي للجذور الهيدروكسيلية صغيرة الحجم والتي تعد مجسات مثالية للتمييز بين النوكليوتيدات المكشوفة للمذيب وتلك المدفونة. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال البيولوجيا البنيوية لـ RNA.

على سبيل المثال، كيف تستخدم الريبوسومات أيونات المعادن للوصول إلى هيئتها النشطة؟ يمكن استخدام بصمة الجذور الهيدروكسيلية لفهم أساسيات خصوصية الـ RNA والتعرف عليه. وبالإضافة إلى الكشف عن معلومات حول البنية الثالثية للـ RNA، يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد مواقع ارتباط البروتين الدقيقة في جزيئات الـ RNA أو الـ DNA.

تتمثل التحديات الرئيسية لهذه الطريقة في منع تحلل العينة بواسطة الريبونيوكليز وتحسين تركيز الحديد من أجل الحصول على القدر المناسب من قطع RNA. كما يمكن أن يكون التحليل التفصيلي للفواصل بين النطاقات معقداً للغاية. وتكمن الفائدة الرئيسية لهذا الفيديو في مساعدة المشاهد على فهم مراحل التخطيط والتنفيذ الناجح لتجربة بصمة جذور الهيدروكسيل. قبل البدء في هذا البروتوكول، قم بتحضير جميع كواشف البصمة كما هو موضح في البروتوكول المكتوب.

بالتزامن مع هذا الفيديو، يمكن إنتاج RNA في أربعة DFOs ذات صلة ووسم نهاياتها كما هو موضح هناك. قم بتنقية RNA المسمى إشعاعياً باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام المفكك. استعد RNA المنقى من خلال عمليتي استخلاص متتاليتين من الهلام باستخدام خلات الصوديوم بتركيز 0.3 molar.

ثم يتم ترسيب RNA عن طريق خلط 0.5 milliliters من المحلول المائي مع 1 milliliter من الإيثانول. يتم تحضين الخليط لمدة دقيقة واحدة على الثلج الجاف. بعد طرد العينة مركزياً، يتم التخلص من الراشح. تُغسل كريّة RNA باستخدام إيثانول بتركيز 70%.

تخلص من الراسوب بعد إجراء عملية طرد مركزي إضافية وجفف الكريّة في الفراغ. بعد ذلك، قم بإذابة عينات RNA المنقاة والموسومة بـ P 32. وفي 330 µL من محلول منظم للتفاعل بتركيز مرة واحدة، انقل 30 µL من محلول RNA باستخدام الماصة إلى أنبوب تفاعل جديد.

قم بترسيب الـ RNA باستخدام الإيثانول ثم جفف الراسب في جهاز تفريغ؛ وبمجرد جفافه، يمكن استخدام هذا الراسب لإنشاء السلم المرجعي كما هو موضح في الإجراء المكتوب. قم بمسخ محلول الـ RNA المعبأ بالمنظم المتبقي عن طريق التسخين عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين. اترك العينات لتبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة، ثم قم بإجراء عملية طرد مركزي سريعة لإعادة المكثفات إلى المحلول. لبدء تجربة البصمة الوراثية، قم بتجهيز 27 أنبوب تفاعل بعدد عينات كافٍ لملء هلام الفصل الكهربائي المكون من 30 بئراً.

بعد تضمين السلالم وعينة التحكم المشطورة، حدد التركيزات النهائية لأيونات المغنيسيوم بحيث تكون موزعة بالتساوي على مقياس لوغاريتمي عبر عدة رتب مقدارية حول نقطة منتصف المعايرة؛ وقد وُصف تحضير أيونات المغنيسيوم في محلول منظم للتفاعل بتركيز 1x في النص بشكل منفصل. قم بحضن الحمض النووي الريبي (RNA) ومحاليل أيونات المغنيسيوم عند 50 °C لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، اخلط 10 µL من محلول RNA مع 90 µL من الكمية المقابلة من محلول أيونات المغنيسيوم.

للوصول إلى حجم نهائي قدره 100 µL، يتم تحضين كل خليط لمدة 30 دقيقة عند 50 °C. بعد ذلك، تُترك المحاليل لتصل إلى حالة التوازن عند 25 °C لمدة ساعة واحدة حتى يتم طي الـ RNA. وفي هذه الأثناء، وقبل البدء مباشرة في تفاعل بصمة الجذور الهيدروكسيلية، يتم تحضير خليط التفاعل الوهمي كما هو موضح في البروتوكول المكتوب.

قم بتحضير تفاعل البيروكسيد عن طريق سحب قطرات بحجم 2 µL لكل من iron EDTA وsodium ascorbate وhydrogen peroxide ووضعها في الجزء العلوي الداخلي من أنبوب التفاعل الذي يحتوي على محلول RNA، بحيث لا تتماس القطرات مع بعضها البعض. ابدأ تفاعل البصمة (footprinting) عن طريق الخلط القوي. بعد 15 ثانية، أوقف التفاعل بإضافة 300 µL من الإيثانول النقي البارد.

قم بقلب الأنابيب من ثلاث إلى خمس مرات. وأخيراً، يتم ترسيب الراسب وغسله وتجفيفه كما تم تنفيذه سابقاً؛ وكبديل للتفاعل التأكسدي البيروكسيدي، يُنفذ تفاعل الهيدروكسيل التأكسدي عن طريق إضافة 5 µL من خليط تفاعل Fenton المُحضر حديثاً إلى العينات. يتم تحضين التفاعل التأكسدي لمدة 30 دقيقة عند 25 °C.

ثم أضف 300 µL من الإيثانول البارد النقي لإيقاف التفاعل، واخلط عن طريق تدوير الأنابيب. قم بالترسيب مرة أخرى. اغسل وجفف الراسب عند اكتمال التفاعل سواء كان تفاعلاً بيروكسيدياً أو تأكسدياً.

أذب حبيبات RNA المجففة في 8 µL من صبغة تحميل الهلام (gel loading dye) رقم 2. تأكد من إعادة تعليق RNA المسمى بـ P 32 باستخدام عداد جيجر، ثم قم بتحضير هلام تسلسل بولي أكريلاميد (poly acrylamide) منزع البروتين بتركيز 8% وفقاً للبروتوكولات القياسية. وباستخدام مشط مكون من 30 بئراً، قم بتحميل العينات، بما في ذلك مرجعين وعينة ضابطة مقسمة (cleaved control).

افصل قطع RNA عند قدرة تتراوح بين 60 إلى 75 واط لمدة ساعتين ونصف. عرّض الهلام المجفف لشاشة فسفورية للتخزين طوال الليل. امسح الشاشة الفسفورية باستخدام نظام تصوير لإجراء تصوير شعاعي ذاتي بدون فيلم.

ثم انقل ملف صورة الهلام إلى الكمبيوتر لإجراء التحليل. لبدء تحليل البيانات، افتح برنامج Safa وهو برنامج مفتوح المصدر لملاءمة الحزم الفردية وتقديرها كمياً. قم بتحميل تتابع RNA كملف بصيغة dot TXT، يليه تحميل صورة الهلام كملف بصيغة dot gel.

حدد المسارات واضبط كثافة النطاقات. ثم اختر مساراً مرجعياً وقم بإجراء محاذاة للهلام (gel alignment) لتعيين النطاقات إلى النيوكليوتيدات بالرجوع إلى سلم هضم T1 الخاص بالحمض النووي الريبي (RNAs). قم بقياس كثافة النطاقات واستخدم ميزة مخطط اللون/التطبيع (normalization slash color plot) لتطبيع وتعيين البقايا التي يحتمل أن تكون ثابتة.

احفظ المخرجات كملف txt. يُنتج برنامج SFA جدول بيانات يحتوي على أعمدة تمثل مسارات الهلام (gel lanes) وصفوف تمثل تكاملات النطاقات الفردية المقابلة لشظية RNA. أولاً، يجب تحديد مواقع الحماية التي تظهر تغيراً ملحوظاً في إمكانية الوصول للمذيب من خلال مقارنة ملف الحماية المستمد من عينة خالية من أيونات المغنيسيوم بملف تركيز أيونات المغنيسيوم عند نقطة النهاية.

كلما انخفضت القيمة، زادت حماية النوكليوتيد ضد هجوم جذور الهيدروكسيل والعكس صحيح. بعد ذلك، قم بإنشاء منحنيات انتقال لشدة النطاق للنوكليوتيدات الفردية أو مجموعات منها مقابل تركيز الحديد والمغنيسيوم باستخدام تنسيق الجداول البيانات، وقم بمقياس هذه الانتقالات بشكل فردي وفقًا لدالة التشبع الكسري كما هو موضح في الجزء النصي من هذا البروتوكول. وكخطوة نهائية، قم بمطابقة البيانات مع معادلة هيل.

يقوم هذا التحليل بمقياس الانتقال إلى التشبع الجزئي، ويحدد نقطة منتصف الانتقال، ويوفر اختباراً ظاهرياً لمعرفة ما إذا كان الانتقال يظهر بشكل سيني. فيما يلي نتائج ممثلة من تجارب بصمة الجذور الحرة للهيدروكسيل لـ P four P six RRNA. تم اشتقاق المنحنيات المتساوية الحرارة من هلامات التسلسل التي حللتها Safa، ثم تمت ملاءمتها كما هو موضح في قسم التحليل.

تُظهر صورة الهلام أن التحلل في الخلفية ضئيل، وأن تعيين النوكليوتيدات المفردة ممكن بفضل النطاقات المحددة جيداً في المسار T one. إن تكسير RNA الناجم عن جذور الهيدروكسيل أعلى بكثير من مستوى الخلفية. ويرتبط الانتقال من تركيزات أيونات المغنيسيوم المنخفضة إلى العالية بشكل انتقائي بانخفاض كثافة النطاقات الفردية ومجموعات النطاقات، مما يشير إلى تكوين RNA.

تشير حماية البنية الثالثية إلى نيوكليوتيد واحد أو مجموعات من النيوكليوتيدات المتجاورة التي يغير انقسامها بشكل متزامن من شدة النطاقات، والتي يتم قياسها وتنميطها بواسطة تحليل saffer. والنتيجة هي مخطط حراري يصور درجة الحماية ضد جذور الهيدروكسيل. ويصف الانتقال اللوني التغير في إمكانية الوصول عند إضافة الحديد والمغنيسيوم؛ حيث يشير اللون من الأبيض إلى الأحمر إلى نيوكليوتيدات أكثر سهولة في الوصول، بينما يشير اللون من الأبيض إلى الأزرق إلى نيوكليوتيدات أكثر حماية.

يرتبط كل درجة من درجات التظليل بقيمة عددية، والتي يمكن تمثيلها كمنحنى حماية وتحليلها باستخدام نموذج ارتباط مثل معادلة hill. في هذا المثال، تكون ثابت تفكك التوازن المرتبط بالحماية 1 5 3 إلى 1 5 5 ضعف القيمة المقابلة للحماية 1 6 3 إلى 1 6 4 تقريبًا. يمكن إجراء تجربة بصمة جذر الهيدروكسيل هذه في غضون يوم ونصف إذا نُفذت بشكل صحيح.

عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر ارتداء القفازات ومعطف المختبر لتجنب أي تلوث بـ RNAs. كما أن تركيز الحديد النهائي يعتمد على النظام التجريبي؛ لذا، نوصي بإجراء تجربة استجابة للجرعة قبل عملية البصمة (footprinting) المتبعة في هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى، مثل بصمة جذور الهيدروكسيل المحددة زمنياً، للإجابة على أسئلة إضافية. على سبيل المثال، في أي نقطة زمنية حرجة تصل جزيئات RNA إلى هيئة مطوية بشكل خاطئ أو هيئة نشطة بعد تطورها؟ لقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا التركيبية لاستكشاف التفاعلات الثالثية الجزيئية البينية والمؤقتة للأحماض النووية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية تحديد تكوين البنية الثالثية لجزيئات RNA. لا تنسَ أن مادة caate والمرحلة الثانية من الفسفور تعتبر مواد خطرة، لذا يوصى باتخاذ احتياطات وقائية، مثل ارتداء القفازات ونظارات الحماية، بالإضافة إلى استخدام درع من البلكسي جلاس أثناء تنفيذ هذا الإجراء.