فيديو معدل الميكروسكوب متحد البؤر المسح الضوئي وMicroendoscopy

يوضح هذا الفيديو كيفية بناء مجهر بؤري ماسح بمعدل فيديو باستخدام مكونات قياسية جاهزة. يعتمد المجهر البؤري الماسح على الحركة المنسقة لمرآتي مسح لتحريك الشعاع عبر المستوى النقطي؛ حيث يتم مسح الضوء المنبعث من المرآة الأولى أفقياً عبر المجموعة الأولى من عدسات الترحيل، والتي تعيده بتركيزه إلى نقطة ثابتة على مرآة المسح الثانية. ثم تُنقل حركة المسح ذاتها عبر عدسات المسح والأنبوب، مما يضع شعاع الضوء المتوسع الآن على الفتحة الخلفية للعدسة الشيئية.

تقوم المرآة الثانية، التي تكون حركتها بطيئة مقارنة بالمرآة الأولى، بمسح المحور Y في آن واحد، مما يسمح بعملية المسح فوق المستوى الموضح وتحته، وبذلك يتم إنشاء نمط مسح مستطيل (raster) على سطح العينة. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول مقارنة بشراء مجهر متاح تجارياً في التكلفة المنخفضة والقدرة على تخصيص الجهاز وفقاً للاحتياجات المحددة لمشروع التصوير. وعند العمل مع أي ليزر، من الضروري اتخاذ تدابير السلامة المناسبة لمنع إصابة العين.

تأكد من ارتداء نظارات السلامة المناسبة لليزر كلما كان ذلك ممكناً. يجب على المشاهدين و/أو الباحثين الذين لا يقومون بمحاذاة الشعاع أو العمل معه ارتداء النظارات دائماً. قم بإزالة جميع الساعات أو المجوهرات اللامعة والعاكسة.

والأهم من ذلك، تأكد من تتبع الحزمة والتحكم فيها في جميع الأوقات عن طريق إنهاء مسارها باستخدام حاجب حزمة أو بطاقة عمل مثبتة. وهذا أمر ضروري للغاية أثناء محاذاة المرايا، حيث يمكن أن يكون مسار الحزمة صعب التنبؤ به. كما يجب ألا يكون مستوى عينيك موازيًا لمسار الحزمة أبدًا.

قم بإيقاف تشغيل الليزر إذا كنت بحاجة إلى عبور مستوى الشعاع قبل تجميع المجهر. تأكد من توفر جميع المعدات اللازمة للبناء، بما في ذلك لوحة التثبيت البصرية (optical breadboard) والكتائف بزاوية 90 درجة، وجميع المرايا والعدسات والمرشح ثنائي اللون (dichroic)، جنباً إلى جنب مع المشابك ومعدات التثبيت المناسبة، وكلا مرآتي المسح والكاشف الضوئي. ومن المفيد أيضاً توفير مولد دوال (function generator) لاختبار عملية المسح والتحكم في المرايا أثناء عملية المحاذاة.

يُنصح بشدة أيضًا بتثبيت لوحة التجارب البصرية (breadboard) بالمسامير لضمان الاستقرار. ابدأ في بناء المجهر بوضع موصل الألياف الضوئية (pigtail fiber ator) في الحامل البصري، ثم ضع هذه المجموعة في منتصف لوحة التجارب البصرية. يتوافق هذا الموضع مع نقطة انطلاق الشعاع الأزرق كما هو موضح هنا.

قم بتشغيل مصدر الضوء. استخدم براغي الضبط لضبط الشعاع بشكل تقريبي بحيث ينتقل في خط مستقيم أفقياً وعمودياً. ضع حجاباً (iris) أمام مجمع الألياف (fiber collator).

بعد ذلك، اضبط ارتفاع الحدقة بحيث يمر الشعاع من خلال المركز. ثم حرك الحدقة بعيداً عن الـ ator على طول مسار الشعاع. تحقق من محاذاة الشعاع.

استخدم مسماري الضبط لإعادة توجيه الحزمة على القزحية إذا لزم الأمر. ضع مرآة الـ diic المثبتة في مسار الحزمة بحيث يتموضع شعاع الليزر في مركز المرآة. قم بتدوير حامل المرآة ليعكس الحزمة بزاوية 90 درجة تقريبًا، مع التأكد من عدم تغير ارتفاع الحزمة.

قم بتثبيت المرآة على الطاولة عن طريق ربط البراغي الموجودة في الحامل. بعد ذلك، ضع المرآة الجلفانومترية الرنينية المثبتة في مسار شعاع الليزر، مع الحرص على التأكد من وضع شعاع الليزر في المركز الأفقي تماماً لسطح المرآة.

قم بتدوير حامل المرآة لعكس شعاع الليزر بزاوية 90 درجة. ثم اضبط انعكاس المرآة بشكل تقريبي للحفاظ على الارتفاع الرأسي ذاته لشعاع الليزر. بعد ذلك، أحضر حجابتين (irises) وضعهما مباشرة أمام الجلفانومتر الرنيني (resonant gal).

بعد ذلك، وباستخدام شعاع الليزر المنعكس من مرآة gal الرنينية كمرجع، حدد ارتفاعها الرأسي كما سبق. والآن، وباستخدام ثقوب البراغي الموجودة على لوحة التجارب البصرية (optical breadboard) كدليل بصري، قم بتثبيت الحجابين (irises) في خط مستقيم. اضبط المرآة الأولى في المسار، وهي المرآة ثنائية اللون (dichroic)، لتركيز الشعاع في مركز الحجاب الأول.

بعد ذلك، قم بضبط المرآة الثانية في المسار. استخدم المجلفنومتر الرنيني (resonant gal) لتركيز الشعاع في منتصف القزحية الثانية. كرر عملية ضبط هاتين المرآتين بشكل تكراري حتى يتم محاذاة الشعاع عبر كلتا القزحيتين.

التأكد من أن شعاع الليزر المنعكس من مرآة الجالفانومتر الرنينية لا يزال ينعكس من مركز المرآة التقريبي. في حالة انحراف الشعاع، يتم ضبط حامل مجمع الألياف وتكرار التعديلات مع توسيط الشعاع على كلا الحجابين المفتوحين. الخطوة التالية هي وضع عدستي التتابع اللتين ستقومان بتصوير المستوى المركزي البعيد الثابت الأول على المستوى المركزي البعيد الثابت الثاني.

بالنسبة لهذا المجهر تحديداً، تمتلك العدسات المختارة في المرحل الأول نفس البعد البؤري F، لذا فإن المسافة بين المرآتين هنا هي ببساطة أربعة F. وفي هذا الإعداد، تساوي F قيمة 90 مليمتر، وبالتالي سيكون موضع 4F على بعد 360 مليمتر من مرآة المسح. ولضمان تمركز العدسات بدقة في مسار الشعاع، ضع العدسة الأولى في مسار الشعاع وانظر إلى بقعة شعاع الليزر على القزحية التالية في المسار. بعد وضع العدسة، اضبط ارتفاعها بحيث يكون المركز العمودي للشعاع عند مركز القزحية.

بعد ذلك، قم بضبط وضع العارضة الأفقية لتوسيط الشعاع على القزحية. كرر هذه العملية مع العدسة الثانية. بعد ذلك، سيتم إعداد مرآة المسح وتدوير المجهر لتسهيل عملية وضع ومحاذاة الأجزاء التي قد تتطلب خلاف ذلك ضبطاً رأسياً.

لتحديد الموضع الدقيق للمستوى المركزي البعيد (tele centric plane) الثاني، قم بتركيب الماسح الجلفانومتري الرنان (resonant galvo) في وحدة المسح الخاصة به وقم بتشغيله. استخدم بطاقة عمل لتتبع مسار شعاع المسح عبر العدستين. سيكون المستوى المركزي البعيد الثاني موجوداً على مسافة تساوي تقريباً أربعة أضعاف البعد البؤري F من الماسح الجلفانومتري الرنان، ويمكن تحديده بأنه الموضع الذي يظهر فيه شعاع المسح ثابتاً.

حدد مكان لوحة التجارب أسفل هذا الموقع باستخدام قلم رصاص. بمجرد تحديد المستوى المركزي عن بُعد (tele centric plane)، اضبط مدخل مرآة المسح على صفر فولت وقم بتشغيل أجهزة التحكم في المرآة بحيث تستقر المرآة في وضعها المحايد. ثم ضع مرآة galil القياسية للمسح في الموقع الدقيق للمستوى المركزي عن بُعد.

قم بتعديل وضعية المرآة بحيث تسقط الحزمة عند المستوى البعيد (tele plane) في المركز تماماً لمرآة المسح، ثم أحكم تثبيت حامل المرآة. الآن، قم بفك برغي القفل الذي يثبت مرآة الجالفانومتر (gal mirror) وقم بتدويرها، مع التأكد من أن الحزمة تنتشر عمودياً. بعد ذلك، قم بإيقاف تشغيل الليزر وإلكترونيات المسح.

افصل الليف البصري وافصل مرايا المسح. ثم باستخدام دعامات تثبيت لوحة التجارب بزاوية 90 درجة، قم بتثبيت لوحة التجارب الثانية في الأولى.

أخيراً، قم بتدوير المجهر بأكمله بعناية بحيث تكون لوحة التجارب (breadboard) الجديدة مستوية، واستخدم المشبك لتثبيت المجهر في موضعه. أعد توصيل الـ gal o والليزر هنا، وتذكر إعادة الـ gal O إلى صفر فولت. يمكن تنفيذ بقية خطوات الإعداد التي كانت رأسية سابقاً بسهولة على لوحة التجارب المستوية.

بعد ذلك، سنقوم بتركيب المجموعة الثانية من عدسات الترحيل والتي يُشار إليها رسميًا باسم عدسة المسح وعدسة الأنبوب. يرجى مراجعة البروتوكول المكتوب المرفق للحصول على معلومات مهمة جدًا حول اختيار المزيج المناسب من العدسات. ابدأ بتركيب العدسات.

أولاً، قم بتوزيع المرايا اللازمة لتوجيه الشعاع إلى العدسة الشيئية. ضع المرآة الكبيرة الأولى ذات البوصتين بالقرب من حافة لوحة التجارب (breadboard)، وأدر حامل المرآة لعكس شعاع الليزر بزاوية 90 درجة تقريباً. اضبط الانعكاس عن المرآة للحفاظ على نفس الارتفاع الرأسي للشعاع.

بعد ذلك، ضع المرآة الأخرى ذات البوصتين عند الحافة المقابلة للوحة التثبيت (breadboard) لتوجيه الشعاع بزاوية 90 درجة، واستخدم براغي الضبط لتثبيتها في مكانها. بعد ذلك، قم بإعداد حجابيّن (irises) واضبط المرآتين كما سبق لتوسيط الشعاع. ثم ضع عدسة المسح على مسافة تساوي طولها البؤري من جهاز الجلفانومتر (gal) في مسار الشعاع، واضبط موضعها الأفقي والرأسي.

لتوسيط بقعة الليزر على القزحية الأولى بين المرآتين. ضع عدسة الأنبوب الكبيرة ذات البوصتين بعناية على المسافة المناسبة من عدسة المسح، واضبط وضعها الأفقي والعمودي لتوسيط الشعاع على القزحية الأولى. في هذا الإعداد، يتم وضع عدسة الأنبوب على مسافة 75 millimeters زائد 300 millimeters مع وجود جميع المكونات في مكانها.

قم بتوصيل gal O بمخرج مولد دوال كهربائي قياسي أو دائرة تحكم، واضبط جهد القمة إلى القمة ليكون بين 1 إلى 3 فولت. بعد ذلك، ابدأ بمسح المرآتين باستخدام بطاقة عمل. حدد موقع شعاع الليزر عند المستوى الثابت، على بُعد 300 millimeters بعد عدسة الأنبوب.

ضع العدسة الشيئية في مسار الحزمة، مع التأكد من وضع الفتحة الخلفية للعدسة الشيئية في أقرب نقطة ممكنة من المستوى الثابت. قم بإعداد منصة العينة، مع التأكد من أن حامل المحور Z القابل للإزاحة لا يصطدم بحامل العدسة الشيئية أثناء تحركه عبر نطاقه. لإعداد النظام البؤري (confocal) والثقب الضيق والكاشف، ابدأ بفصل جميع مصادر الطاقة والألياف البصرية.

قم بتدوير مجموعة المجهر بحيث تستقر مرة أخرى على لوحة التثبيت، مع تثبيت مرآة المسح الرنينية. بعد إعادة توصيل الليف البصري بالموازِ والمرآة المسحية القياسية، وكابلات الطاقة والتغذية والتحكم، قم بضبط جهد التحكم الذي يشغل الجلفانومتر المسحي القياسي على صفر فولت كما تم مسبقاً على المنصة، ثم ضع عينة من صبغة ساطعة محصورة بين شريحتين غطائيتين. بعد ذلك، قم بتشغيل مصدر الليزر واضبط تركيز الصبغة.

قم بضبط قدرة الليزر لجعل الفلورة ساطعة قدر الإمكان باستخدام بطاقة عمل. تتبع انبعاث الفلورة من العينة عبر العدسة الشيئية ومن خلال نظام المسح وصولاً إلى المرآة ثنائية اللون (dichroic mirror)، والتي تعكس شعاع الليزر وتمرر انبعاث الفلورة. حدد موقع إشارة الفلورة هذه على الجانب الآخر من المرآة ثنائية اللون.

قم الآن بتخفيف إضاءة الغرفة. ضع مرآة خلف المرآة ثنائية اللون (dichroic mirror) لعكس الانبعاث بزاوية 90 درجة. ثم باستخدام حاجب ضوئي (iris) مزود بمرآة، وجه شعاع الفلورة ليكون مستقيماً وموازياً للوحة التثبيت (breadboard) قدر الإمكان.

بعد ذلك، سيتم إعداد وحدة الثقب الضوئي المجهرية (confocal pinhole) باستخدام مجموعة تثبيت القفص للمرشح المكاني من شركة Thor Labs. يوضح هذا المخطط آلية الإعداد. تقع مرآة المسح في مستويات ثابتة تكون في وضع التماس عن بُعد (tele) مع شيئية ثابتة.

تعمل أزواج العدسات الموجودة بين المستويات الثابتة في مستوى الفتحة الخلفية على نقل الأشعة الممسوحة. تمتلك مجموعة العدسات الأولى أطوالاً بؤرية متساوية مما يشكل تلسكوباً بنسبة واحد إلى واحد. أما مجموعة العدسات الثانية، والمعروفة رسمياً بعدسة المسح وعدسة الأنبوب، فلا يشترط أن تكون متساوية في الطول البؤري، وغالباً ما تعمل كتلسكوب لتوسيع الأشعة لضمان ملء الفتحة الخلفية للعدسة الشيئية بشكل زائد.

ينتقل الضوء المنبعث من العينة عائداً عبر نظام المسح ويمر من خلال المرآة ثنائية اللون. تقوم عدسة ذات بؤرة قصيرة أو عدسة شيئية بتركيز ضوء الانبعاث عبر الثقب البؤري المشترك (confocal pinhole)، والذي يتم تجميعه بعد ذلك بواسطة عدسة. ثم تقوم عدسة نهائية بتركيز الانبعاث المفلتر البؤري المشترك على أنبوب مضاعف ضوئي.

ضع وحدة المرشح المكاني على استقامة مسار شعاع الانبعاث، مع الحرص على توسيط حامل عدسة التركيز الأولى على شعاع الانبعاث. وفي هذه الحالة، تم اختيار وحدة مرشح مكاني بفتحة دبوسية حجمها 100 microns. بعد ذلك، قم بتركيب عدسة ذات طول بؤري قصير في الوحدة وحرك حامل الإزاحة Z حتى يمكن ملاحظة بؤرة واضحة على سطح الفتحة الدبوسية.

تأكد من توجيه الوحدة بأكملها على طول الخط المستقيم الذي يحدده الشعاع الفلوري. قم بتثبيت الوحدة على لوحة التجارب (breadboard). الآن، وباستخدام مقابض الضبط الموجودة في منصة الإزاحة، قم بضبط المحورين لإجراء بحث ثنائي الأبعاد عبر سطح حامل الثقب (pinhole mount) للعثور على النقطة التي تصل فيها الإشارة الفلورية عبر الثقب إلى حدها الأقصى.

بعد ذلك، ضع عدسة الطلاء على حامل القفص بعد الثقب الدقيق، وباستخدام بطاقة عمل، حدد الأيون الفلوري الذي يمر عبر وحدة البؤرة المشتركة (confocal unit)، ثم حرك عدسة الطلاء على طول القوائم حتى يصبح الفلورسنس المنبعث مجمعاً قدر الإمكان. قم بتجهيز مجموعة أنبوب مضاعف التصوير الضوئي. ضع عدسة بطول بؤري 50 millimeter في مسار شعاع الانبعاث الفلوري وحدد نقطة بؤرتها.

ضع علامة عند هذا الموضع على لوحة التجارب. الآن، قم بإيقاف تشغيل الليزر تماماً وقم بتوجيه أنبوب مضاعف الضوء بحيث تكون نافذته أقرب ما يمكن من النقطة البؤرية المحددة. ثم باستخدام أنابيب العدسات القابلة للتعديل، قم بتوصيل المجموعة بعدسة التركيز.

لُفَّ شريطاً لاصقاً معتماً حول جميع مسارات الحزمة المكشوفة التي تلي الثقب الدقيق، ثم شَغِّل الليزر مع الحفاظ على قدرته منخفضة للغاية. شَغِّل أنبوب المضاعف الضوئي مع قراءة جهده بدقة على راسم الإشارات. ومع زيادة شدة الليزر، زِد الجهد حتى تظهر قراءة على شكل نبضة حادة و/أو إزاحة مستمرة (DC offset) على شاشة راسم الإشارات.

تأكد من أن هذه الإشارة ناتجة بالفعل عن الفلورة عن طريق إطفاء طاقة الليزر أو حجب مسار الحزمة لملاحظة فقدان الإشارة. وأخيرًا، قم بمحاذاة الثقب الدقيق (pinhole) بشكل تكراري للحصول على أقصى إشارة على راسم الإشارة (oscilloscope). ومن خلال التحكم أولاً في موضع العدسة البؤرية Z ثم ضبط مرحلة الإزاحة YZ، تكتمل عملية إعداد أجهزة المجهر بمعدل الفيديو.

أولاً، قم بإيقاف تشغيل أنبوب مضاعف الضوء. الآن، قم بتوصيل لوحات التحكم المخصصة للمرايا وجهاز الكمبيوتر كما هو موضح في المخطط الوارد في البروتوكول المكتوب المرفق. يمكن تكييف هذا النظام لإجراء التنظير المجهري المسحي البؤري.

عند استبدال المنصة بمنصة تثبيت الألياف، يرجى مراجعة النص أو التفاصيل المرفقة. يجب أن يظهر المجهر البؤري الماسح الرأسي والمنظار الدقيق المكتمل كما هو موضح هنا. تم رسم حزم الليزر والانبعاث كدليل بصري.

أثناء عملية التنظير المجهري، يقوم حامل الألياف بتثبيت ليف الصورة في مكانه لإجراء التجارب. ويمكن استبدال حامل الألياف هذا بسهولة بمنصة XY وفقاً للاستخدامات. وتُظهر منصة المجهر الرأسي هنا صورة اختبار نموذجية لحرف M صغير مطبوع على بطاقة عمل بيضاء، حيث استُخدمت بطاقة التقاط إطارات بمعدل الفيديو لإنشاء صور من الإشارة الواردة. مبيّضة.

تحتوي الورقة البيضاء على قوى فلورية تثار بسهولة بواسطة الأشعة فوق البنفسجية والضوء الأزرق، مما يؤدي إلى ظهور خلفية ساطعة خلف المناطق الداكنة. تم اختيار مرشح انبعاث مركزه 515 nanometers لتجميع هذا الانبعاث الفلوري. يمكن ملاحظة تشوه طفيف في الصورة، خاصة بالقرب من الحواف الجانبية لإطار الصورة.

ينتج هذا التشوه عن نمط المسح الجيبي لمرآة gvo التي تعمل بتردد ثمانية كيلو هيرتز، وهو موضح بالتفصيل في المستند المرفق. يعرض هذا المقطع بيانات معدل فيديو عينة تم الحصول عليها من خلال مسح بطاقة عمل. بعد مشاهدة هذا المقطع، يجب أن تكون لديك الآن رؤية جيدة حول كيفية بناء وضبط مجهر مسحي بؤري بمعدل فيديو.

تذكر أن العمل باستخدام ضوء الليزر قد يكون خطيراً للغاية، لذا يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة عند تنفيذ هذا الإجراء، مثل نزع جميع المجوهرات العاكسة وتجنب العمل بحيث تكون العين في مستوى خط الشعاع.