ذات دقة عالية الألياف الضوئية للMicroendoscopy في الموقع الخلوية التصوير

تقليدياً، كانت الدراسات البيولوجية والسريرية التي تتطلب تحليلاً مجهرياً بدقة الخلية تُجرى عن طريق تنفيذ تجارب متعددة بالتوازي مع إزالة عينات فردية من الدراسة في نقاط زمنية متتالية لتقييمها بواسطة المجهر الضوئي، وبينما تُعد المجهرية البؤرية والمجهرية متعددة الفوتونات ومجهر التوافقي الثاني تقنيات مفيدة للتصوير في الموقع، إلا أن البنية التحتية المطلوبة لها معقدة ومكلفة، حيث تتضمن أنظمة مسح ليزرية ومصادر ضوئية معقدة. ونقوم هنا بتوضيح كيفية بناء نظام منظار مجهري عالي الدقة يعمل بالألياف الضوئية في يوم واحد، باستخدام مكونات جاهزة بتكلفة تقل عن 5,000 دولار أمريكي.

توفر المنصة مرونة فيما يتعلق بدقة الصورة، ومجال الرؤية، وطول موجة التشغيل. أولاً، يتم تجميع هيكل بسيط لمجهر فلوري بالإنارة العلوية (epi fluorescence microscope) لاستيعاب مصدر ضوئي، وفلاتر بصرية، وعدسات، وحزمة ألياف بصرية، وكاميرا CCD. بعد ذلك، يتم تركيب عدسات التصوير التي تشكل صورة مكبرة لحزمة الألياف البصرية على كاميرا CCD.

يتم بعد ذلك تركيب مصدر LED مع بصريات إضاءة لتوفير ضوء استثارة فلوري للعينة. وأخيراً، وباستخدام المنظار الدقيق المُجمّع، يكشف التصوير في الوقت الفعلي عن تفاصيل على المستوى الخلوي للعينات الموصومة فلورياً، بما في ذلك المزارع المخبرية (in vitro)، والنماذج الحيوانية الحية (in vivo)، والأشخاص من البشر. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل المجهر البؤري أو المجهر متعدد الفوتونات، في أنها بسيطة وغير مكلفة بدرجة كافية تسمح للباحثين العاملين في مجموعة متنوعة من المجالات بتطبيقها بسرعة وتخصيصها لتلبية احتياجاتهم المحددة.

يجب اعتبار المنظار المجهري الدقيق عالي الدقة الموصوف هنا بمثابة تكوين أساسي مع إمكانية إجراء عدة تنويعات في التجميع والتطبيق. عند اختيار المكونات لتطبيق معين، يجب مراعاة العلاقات المتأصلة في المجهر الفلوري بين تركيز الفلوروفور، وإضاءة التبييض الضوئي، والشدة، وحساسية الكاميرا، والربح (gain)، ووقت التعريض. تم تصميم هذه المنصة ليتم استخدامها مع pro flavin كعامل تباين فلوري، ولكن يمكن تهيئتها للعمل مع صبغات فلورية أخرى.

يعتبر Pro flavin صبغة نووية ساطعة تبلغ أطوال موجات الامتصاص والانبعاث القصوى لها 445 nanometers و 515 nanometers على التوالي. يتطلب استخدام عوامل تباين أخرى من المستخدم اختيار مرشحات الإثارة والانبعاث والمرشحات ثنائية اللون بشكل مناسب لتجميع نظام المنظار المجهري؛ ابدأ بتوصيل قضيبين من قضبان القفص بطول ست بوصات بقضيبين من قضبان القفص بطول 1.5 بوصة لتكوين زوج من القضبان بطول 7.5 بوصة. قم بربط القضبان في أحد أوجه وحدة المرآة القابلة للطي، ثم قم بتركيب مرآة بقطر بوصة واحدة.

بعد ذلك، قم بربط أربعة قضبان بطول 0.5 بوصة في الوجه المقابل لوحدة مرآة الطي. قم بتمرير مكعب القفص فوق قضبان القفص بطول 7.5 بوصة عبر الفتحتين السفليتين. ثم قم بربط القضبان بطول بوصتين في الوجه الجانبي لمكعب القفص.

باستخدام محول من C mount إلى SM one، قم بتثبيت الكاميرا بصفيحة القفص. ثبّت صفيحة القفص على قضبان القفص بقطر 0.5 inch بحيث تكون محاذية لوجه وحدة المرآة القابلة للطي. اختر عدسة أنبوبية بقطر one inch لتشكيل صورة للحزمة الليفية البصرية على الكاميرا.

يجب اختيار البعد البؤري للعدسة بحيث يتم أخذ عينات من مخرجات الحزمة الليفية بواسطة بكسلين على الأقل. عند التصوير باستخدام الكاميرا، أدخل العدسة في أنبوب عدسة بطول ثلاث بوصات وثبت العدسة باستخدام حلقة تثبيت. ويعد مفتاح الربط المسنن مفيداً لربط حلقات التثبيت في أنابيب العدسات الطويلة.

ضع مرشح الانبعاث داخل أنبوب العدسة قياس ثلاث بوصات فوق حلقة التثبيت الأولى، ثم أضف حلقة أخرى لتثبيت المرشح في مكانه. تأكد من أن توجيه المرشح يتوافق مع الاصطلاح المحدد من قبل الشركة المصنعة للمرشح. قم بربط أنبوب العدسة في جانب مكعب القفص الأقرب إلى كاميرا CCD.

تم توضيح هذا الموضع هنا أيضاً. لاحظ أنه في المخطط، تظهر هذه العدسة والمرشح بدون أنبوب العدسة الذي يبلغ طوله ثلاث بوصات. ومن أجل الوضوح، قم بتوصيل الكاميرا بجهاز كمبيوتر وعرض الصورة على الشاشة.

وجّه تجميعة القفص نحو جسم بعيد وحرك مكعب القفص على طول القضبان حتى تظهر صورة الجسم بوضوح. استخدم مفك براغي لإحكام ربط البراغي الأربعة الموجودة على جوانب مكعب القفص. حيث تقوم هذه البراغي عند إحكام ربطها بالثبات على القضبان لتثبيت المكعب في موضعه.

سيضمن ذلك أن تقوم عدسات الأنبوب بتكوين صورة مركزة لحزمة الألياف على الكاميرا عند دمجها مع العدسة الشيئية المصححة لللانهاية. بعد ذلك، أدخل المرآة ثنائية اللون (diic mirror) في الحامل وضعها بزاوية 45 درجة في مكعب القفص. قم بربط العدسة الشيئية عبر محول سن لولبي من RMS إلى SM1 وأنبوب عدسة قابل للتعديل في وجه مكعب القفص المقابل لحامل عدسة الأنبوب.

بعد ذلك، قم بربط موصل SMA في لوحة قفصية وثبتها على القضبان عند مسافة العمل التقريبية للعدسة الشيئية. أضف اللوحة القاعدية والغطاء الطرفي إلى الجوانب المفتوحة من مكعب القفص. ثم قم بتثبيت LED على لوحة قفصية ومررها إلى نهاية القضبان ذات البوصتين.

أضف عدسة إلى أنبوب عدسات بقطر 0.5 بوصة بحيث عندما يتم ربط هذا الأنبوب في جانب مكعب القفص، يشكل صورة لمصباح LED تملأ الفتحة الخلفية للعدسة الشيئية. كذلك، أضف مرشح الإثارة إلى أنبوب العدسات. في هذه المرحلة، يمكن استخدام مشغل LED للتحكم في شدة الضوء المسلط باستخدام الإيبوكسي.

قم بتوصيل موصل SMA لألياف بصرية بقطر 1030 ميكرون بحزمة الألياف البصرية ذات مجال الرؤية بقطر 720 ميكرون. لمزيد من التفاصيل حول عملية توصيل الألياف البصرية، يرجى الرجوع إلى Thor labs، رقم القطعة FN 96: دليل توصيل وصقل الألياف البصرية.

قم بربط حزمة ألياف موصل SMA في مقبس SMA المثبت على قضبان القفص. وجه الطرف البعيد من الحزمة نحو مصدر ضوء عريض النطاق، ويمكن الاكتفاء بالإضاءة الفلورية. بعد ذلك، راقب صورة الوجه القريب للحزمة على كاميرا CCD. وأخيراً، اضبط موضع العدسة الشيئية عن طريق ربطها داخل أو خارج مكعب القفص.

حتى تظهر صورة حزمة الألياف بوضوح، يجب أن يكون السبب الفردي مرئياً بشكل جلي. يمكن زيادة الدقة المكانية للمنظار الدقيق من خلال تركيب عدسة دقيقة أو مجموعة عدسات في الطرف القاصي لحزمة الألياف. يتم تكوين هذه البصريات بحيث يتم تصوير الطرف على سطح النسيج بتكبير محدد، بدلاً من وضع طرف الحزمة مباشرة على النسيج.

وبذلك تزداد ترددات أخذ العينات المكانية التي تفرضها خاصية توجيه الضوء في حزمة الألياف. وتتناسب درجة تكبير dem مع الزيادة في الدقة المكانية، وفي الوقت ذاته، مع انخفاض تناسبي في مجال الرؤية. اختر عدسة grin بالتكبير ومسافة العمل المطلوبين لتطبيقك.

تأكد من أن قطر العدسة يطابق قطر حزمة الألياف التي تخطط للعمل بها. قم بتركيب حزمة الألياف وعدسة grin على منصات تحديد مواقع يدوية منفصلة ثلاثية المحاور تحت مجهر منخفض القوة أو مجهر ستيريوسكوبي لضمان المحاذاة الدقيقة.

ضع بعد ذلك قطرة من اللاصق البصري على وجه العدسة أو حزمة الألياف. وباستخدام أدوات التحديد اليدوي، اجعل المكونين في حالة تلامس. ثم عرّض السطح البيني للأشعة فوق البنفسجية وفقاً للجرعة الموصى بها من قبل الشركة المصنعة لتصلب اللاصق.

لحماية عدسة التدرج المعياري (grin lens) والواجهة الملتصقة، استخدم قطعة قصيرة من أنابيب الشعيرات الألومنيومية لتطويق الوصلة. قم بتمرير الأنبوب فوق الوصلة وثبته في مكانه بوضع قطرة من الإيبوكسي عند كل طرف من طرفي الأنبوب، ثم استخدم أنابيب الانكماش الحراري لإنهاء عملية التجميع. قبل التصوير بالمنظار الدقيق، قم بتطبيق عامل التباين على الخلايا أو الأنسجة المراد تصويرها لتصوير الخلايا والمزارع الخلوية.

أولاً، قم بإزالة وسط النمو باستخدام الماصة. ثم أضف محلول البروبيديوم فلافين عن طريق السحب والضخ بلطف داخل البئر. بعد فترة حضانة قصيرة تصل إلى دقيقة واحدة، قم بإزالة محلول البروبيديوم فلافين باستخدام الماصة وتخلص منه.

اشطف الخلايا بإضافة وإزالة محلول PBS طازج إلى البئر، ثم قم بتثبيت الطرف القاصي من الحزمة الليفية في مثبت محكم مزود بمراحل تحديد مواقع يدوية على المحاور x وY وZ لضمان الاستقرار. أثناء التصوير، وبعد تطبيق الصبغة على الخلايا أو الأنسجة، ضع الحزمة الليفية البصرية في تلامس خفيف مع العينة. استعرض صورة الحزمة الليفية البصرية على شاشة الكمبيوتر، إما باستخدام البرنامج المرفق من الشركة المصنعة للكاميرا أو أي برنامج مخصص قد ترغب في تطويره.

قم بضبط وقت التعريض وإعدادات الكسب للكاميرا للحصول على صورة ذات سطوع مقبول. عند تجميعه بشكل صحيح، سيعمل المنظار الدقيق كمجهر فلوري فوقي يتم نقله عبر حزمة من الألياف الضوئية المترابطة. وللحصول على أفضل نتائج التصوير، يجب الاهتمام بالتأكد من استيفاء ثلاثة شروط أساسية.

أولاً، يجب تصوير الوجه القريب لحزمة الألياف على كاميرا CCD دون فقدان التركيز البؤري من أجل تحقيق الدقة الكاملة للنظام. هنا، تم تصوير جزء من حزمة ألياف بتركيز بؤري ضعيف، وتركيز جزئي، وتركيز جيد. ويتم تحديد التركيز الأمثل عن طريق ضبط الموضع الفعلي للعدسة الشيئية بالنسبة لوجه الحزمة.

ثانياً، يجب إضاءة الوجه القريب لحزمة الألياف بشكل منتظم عبر قطرها الكامل. وكما تم وصفه سابقاً، يتم تحقيق ذلك من خلال تهيئة بصريات الإضاءة للإضاءة المتساوية (cola illumination). وقد تم الحصول على الصورة المعروضة هنا عند إضاءة عينة فلورية منتظمة في هذا التكوين المفضل.

تظهر هنا النتيجة المقابلة تحت الإضاءة الحرجة. حيث يتم تصوير بنية الـ LED على وجه حزمة الألياف، مما يؤدي إلى ظهور هذا النمط غير المرغوب فيه متراكباً على البنية الحقيقية للعينة. ثالثاً، من المهم التأكد من أن كلا الوجهين القريب والبعيد لحزمة الألياف نظيفان وخاليان من الخدوش والكسور.

في هذا المثال، تلتصق شوائب صورية بوجه الحزمة، ويظهر تلف على شكل شظية صغيرة عند وضع الساعة الخامسة على محيط الليف. يمكن إزالة الشوائب من وجوه الحزمة عن طريق التنظيف بنفس طريقة الموصلات التقليدية للألياف الضوئية باستخدام ورق العدسات والإيزوبروبانول أو أدوات تنظيف الألياف الضوئية القياسية. تم وسم 1483 خلية بـ pro flavin، ثم وُضعت حزمة الألياف العارية برفق فوق العينة.

يظهر هنا التصوير المختبري (In vitro) عند ربط عدسة GRIN بقوة 2.5x بطرف الحزمة، حيث تم تحقيق تحسن في الدقة المكانية وتقليل في مجال الرؤية. تم إجراء التصوير الحي (In vivo) من خلال تمرير حزمة ألياف بقطر خارجي 0.5 millimeter عبر إبرة قياس 21 gauge وإدخالها في نسيج الوسادة الدهنية للثدي لدى الفأر كما هو موضح في هذا المقطع، حيث تظهر الخلايا الدهنية بوضوح مع وجود حركة ناتجة عن الدورة القلبية. وفي هذا المثال، تم تصوير المخاطية الفموية لمتطوع بشري سليم باستخدام حزمة ألياف أكبر بقطر خارجي 1.5 millimeter.

في جميع الأمثلة، استُخدم pro flavin كعامل تباين فلوري لوسم النواة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية تصميم وتجميع منظار مجهري بالألياف الضوئية للتصوير الفلوري ثنائي الأبعاد للخلايا والأنسجة.