في يوم واحد خطة سير العمل للكشف عن مسببات الأمراض البكتيرية ومضادات الميكروبات اختبار المقاومة من زرع الدم

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد وتقييم الحساسية للمضادات الحيوية لعزلات المزارع الدموية في وقت أقل مما تتطلبه الطرق التقليدية. ويتم تحقيق ذلك من خلال تحديد عزلة المزرعة الدموية أولاً، باستخدام مقايسة MultiPro PCR المبتكرة للحمض النووي الريبوزي 16 s.

بعد ذلك، يتم تحضين العزلة مع مجموعة من المضادات الحيوية لمدة ست ساعات. والخطوة التالية هي تحديد النمو أو تثبيط نمو العزلة في وجود المضاد الحيوي باستخدام مقايسة 16 s ribosomal D-N-A-P-C-R الكمية. وفي النهاية، تظهر النتائج أنه يمكن الحصول على تعريف العزلة الناتجة عن مزرعة دم واختبار حساسيتها للمضادات الحيوية بشكل أسرع من خلال هذا المزيج من المزرعة وتفاعل البوليميراز المتسلسل PCR.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل تلك التي تستخدم أنظمة phoenix الآلية أو أنظمة IIC، في عدم اشتراط حالة استزراع مسبقة، وفي إمكانية الحصول على نتائج تحديد الهوية واختبار الحساسية للمضادات الحيوية في اليوم ذاته. سيقوم Vandy Hanson وGID، طلاب الدكتوراه من مختبرنا، باستعراض الإجراء. خفف 100 µL من مزرعة دم موجبة للنمو الميكروبي في أنبوب تفاعل يحتوي على 900 µL من كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9%. ثم قم بطرد العينة مركزياً عند 13,400 ×g لمدة خمس دقائق لترسيب البكتيريا بعد عملية الطرد المركزي.

يا ريس، قم بتعليق الراسب في 100 µL من الماء المقطر المعقم. واحفظ العينة عند درجة حرارة 4 °C لحين الاستخدام. وبمجرد تجهيز جميع العينات، قم بتحضير خلائط تفاعل PCR في الوقت الحقيقي لتضخيم 16 s ribosomal DNA محدد من البكتيريا المستهدفة.

استخدم الماء منزوع المعادن لضبط الأحجام لتصبح 20 µL لكل تفاعل. وزع 20 µL من خليط PCR في كل بئر من آبار لوح PCR المكون من 96 بئراً. ثم أضف 5 µL من العينة إلى كل بئر وأغلق لوح PCR بإحكام.

بعد ذلك، قم بإجراء تفاعل البلمرة المتسلسلة (PCR) باستخدام نظام A BI Prism 7, 900 HT real-time PCR، ولتحليل النتائج فور اكتمال التفاعل، استخدم أولاً علامة تبويب إعدادات التحليل (analysis settings) لضبط تحليل CT على 0.1. ثم قم بتضييق تكوينات خط الأساس (baseline configurations) لتبدأ من الدورة السادسة وتنتهي في الدورة 15. سجل قيمة CT لكل عينة.

يمكن بشكل عام تعيين قيمة القطع لاعتبار نتيجة PCR إيجابية عند قيمة CT تبلغ 35. وفي هذا المثال، يظهر ملف التعريف التعريفي لمزرعة دم مصابة ببكتيريا e coli في مزيجين من تفاعلات PCR. تم تضمين بادئات rDNA 16s العامة، والتي أنتجت منحنيين لتضخيم الحمض النووي بقيم CT تبلغ 25.2 و 25.95.

تُشتق منحنى التضخيم الثالث من المسبار النوعي لـ Coli. ولم تولد المسابر النوعية الأخرى إشارات يمكن اكتشافها. وبمجرد تحديد المسبب المرضي، يمكن إجراء اختبار المضادات الحيوية.

ابدأ بنقل خمسة ملليلترات من المرق من مزرعة دم إيجابية إلى أنبوب فصل المصل. قم بطرد العينة مركزياً عند 2000 ×g لمدة 10 دقائق، وبعد عملية الطرد المركزي، تخلص من السائل العلوي من الأنبوب. ثم باستخدام مسحة قطنية معقمة، انقل البكتيريا من الطبقة الهلامية للأنبوب إلى 0.9% sodium chloride حتى يتم الحصول على محلول بعكارة تعادل معيار 0.5 McFarland.

يعادل هذا حوالي 1.5 × 10⁸ وحدة تشكيل مستعمرة لكل مليلتر. بعد ذلك، قم بتخفيف المعلق في مرق مولر-هينتون (Muller Hinton) بتركيز مضاعف للحصول على تركيز يبلغ حوالي 5 × 10⁵ وحدة تشكيل مستعمرة لكل مليلتر.

قم بتوزيع 50 µL من المعلق في كل بير من صفيحة معايرة دقيقة تحتوي مسبقاً على 50 µL من مجموعة مختارة من المضادات الحيوية في كل بير. تأكد من تضمين ضوابط نمو إيجابية لكل عينة باستخدام آبار تحتوي على الماء بدلاً من المضادات الحيوية. قم بتغطية الصفيحة عند الانتهاء.

ثم تُحضن الصفيحة عند 37 درجة Celsius لمدة ست ساعات للسماح بنمو البكتيريا. تأكد من تخزين جزء من المعلق البكتيري عند 4 درجة Celsius كعينة ضابطة سلبية للنمو. بعد فترة التحضين التي استمرت ست ساعات، انقل محتوى كل بئر وعينة الضابط السلبي إلى أنابيب معقمة منفصلة.

بعد إجراء عملية طرد مركزي لمدة خمس دقائق عند 16,000 ×g، يتم إزالة 80 µL من السائل الطافي وإعادة تعليق الرواسب في 80 µL من الماء منزوع المعادن والمعقم. تُخفف العينات بنسبة 1:10 في الماء قبل استخدامها في تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (real-time PCR) للحمض النووي الريبوزي 16S rDNA.

قم بتحضير خليط PCR باستخدام IQ cyber green super mix وبادئات 16 s ribosomal DNA، ثم وزع 20 µL لكل بئر في صفيحة PCR ذات 96 بئراً. بعد ذلك، أضف 5 µL من كل عينة إلى الآبار وأغلق الصفيحة بإحكام.

بعد ذلك، قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتحليل النتائج. أولاً، احسب قيمة CT الحدية. وبشكل عام، تكون قيمة CT الحدية مساوية لقيمة CT لضابط النمو الموجب زائد 0.5 مضروبة في قيمة CT لضابط النمو السالب ناقص قيمة CT لضابط النمو.

ومع ذلك، بالنسبة للبيبيراسيلين مع تازوباكتام و CEF dazadi في العصويات سالبة الجرام، وكذلك بالنسبة للأموكسيسيلين والأوكساسيلين والتريميثوبريم مع السلفاميثوكسازول في المكورات العنقودية الذهبية (staphylococcus aureus) أو من الأموكسيسيلين في أنواع المكورات المعوية (enterococcus SPP)، يجب خفض معامل الضرب من 0.5 إلى 0.25. ويمكن تحديد مدى حساسية أو مقاومة السلالات في كل عينة من خلال مقارنة قيمة CT للعينة بقيمة cutoff ct.

تشير قيمة CT التي تتجاوز الحد الفاصل إلى القابلية للتأثر، بينما تشير القيمة التي تقل عن الحد الفاصل إلى المقاومة. إليكم مثالاً على مخطط تضخيم لاختبار القابلية للتأثر بالمضادات الحيوية. تم اختبار سلالة e coli التي تم تحديدها سابقاً لقياس حساسيتها لعدة مضادات حيوية، حيث يمثل كل منحنى منها مضاداً حيوياً منفصلاً.

تعتبر العينات ذات قيمة CT منخفضة عينات حدث فيها نمو في وجود مضاد حيوي، مما يشير إلى مقاومة المضاد الحيوي المختبر. وعلى العكس من ذلك، تمثل قيمة CT المرتفعة عينة لم يحدث فيها نمو، مما يشير إلى الحساسية للمضاد الحيوي المختبر. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجازها في غضون تسع ساعات إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.