الإنتاجية العالية لطريقة الكشف عن فيروس الإنفلونزا

الهدف العام من هذا الإجراء هو التقدير الكمي الفعال لعيارات الفيروسات في المجاري التنفسية للفئران المصابة بالإنفلونزا. يتم أولاً تلقيح الفئران عن طريق الأنف بفيروس الإنفلونزا في نقاط زمنية محددة بعد العدوى.

يتم التضحية بـ M وجمع سائل غسيل القصبات والأسناخ الرئوية أو سائل BAL. بعد ذلك، يُستخدم سائل BAL لإصابة خلايا MDCK. ويمكن بعد ذلك صبغ الخلايا المصابة للكشف عن وجود البروتينات الفيروسية باستخدام أجسام مضادة أولية محددة، تليها أجسام مضادة ثانوية مقترنة بالأشعة تحت الحمراء.

تُقرأ الإشارات تحت الحمراء باستخدام ماسح Lycor Odyssey، ويمكن استخدام برنامج Odyssey لتحديد العيارات الفيروسية. ومن خلال استخدام منحنى قياسي، يمكن الحصول على تقدير كمي للعيارات الفيروسية. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في التحديد الكمي الدقيق للعيارات الفيروسية، وقابلية التكرار، والحجم الضئيل المطلوب لإجراء هذا المقايسة.

يمكن توسيع تطبيقات هذه التقنية لتشمل تشخيص وعلاج مختلف الأمراض الفيروسية التنفسية، حيث يمكن استخدامها لتقدير العيارات الفيروسية في العينات السريرية بعد اتباع هذا الإجراء. ويمكن إجراء طرق أخرى مثل QPCR للإجابة على تساؤلات إضافية مثل عدد النسخ الفيروسية. وعند تطبيق هذه التقنية، من المهم تذكر التحقق من الفيروس الضابط لمعيار العيار بعد هذه العملية.

تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الفيروسات لاستكشاف عيار الفيروس أو صبغ البروتين الفيروسي في العينات السريرية. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون 17 ساعة. يتم تنفيذ الإجراء بدقة كالتالي: يتم حقن الفئران عن طريق الأنف بـ 5,000 وحدة تشكيل لوحية أو PFU من فيروس الإنفلونزا PR eight في 30 µL من محلول PBS العقيم، أو باستخدام PBS وحده كمجموعة ضابطة سلبية. ولجمع سائل غسيل القصبات الهوائية (BAL) من الحيوانات التي تم قتلها رحيمًا، يتم أولاً فتح التجويف الصدري وعمل شق بطول 1 cm موازٍ للقصبة الهوائية لكشفها باستخدام مقصات عقيمة دقيقة.

قم بعمل شق صغير في القصبة الهوائية، ثم احقن القصبة الهوائية بـ 0.5 milliliters من PBS المحتوي على 1%BSA، وقم بشفط سائل الغسيل برفق. قم بتخزين سوائل BAL في درجة حرارة 20- degrees centigrade لتقدير العيارات الفيروسية في سوائل الغسيل. أولاً، قم باستزراع 5 million من خلايا MDCK في 20 milliliters من RPMI الكامل في دورق T 75 طوال الليل عند درجة حرارة 37 degrees centigrade، وفي اليوم التالي، قم بحصاد الخلايا وزراعتها في طبق أسود ذي قاع مسطح وبصري يحتوي على 96 well بمعدل 10,000 cells لكل well.

بعد ذلك، يتم تحضين الطبق طوال الليل عند 37 °C. يتم سحب السائل الطافي برفق وغسل الخلايا مرتين باستخدام وسط DMEM كامل ولكن خالٍ من المصل، بحيث يحتوي على 0.2% BSA بدلاً من FBS. وبمجرد غسل الخلايا، يتم إضافة 50 µL من سائل BAL أو 50 µL من معلق يحتوي على تركيز معروف من الفيروس لكل بئر.

ثم أضف 50 µL لكل بئر من وسط DMEM، وهو وسط يحتوي على التربسين المعالج بـ TPCK بتركيز 0.2 µg/mL لتعزيز التصاق الفيروس ودخوله وتكاثره. حضن الخلايا لمدة ساعة واحدة عند 37 °C للسماح للفيروس بالامتصاص. ثم أضف 100 µL من FBS يحتوي على وسط RPMI كامل إلى كل بئر، وزرع الخلايا طوال الليل للسماح بانتشار العدوى بعد فترة التحضين الليلية.

اغسل الخلايا بـ 100 µL من 1%B-S-A-P-B-S. بمجرد غسل الخلايا، أضف 100 µL لكل بئر من 1%para formaldehyde وحضن الأطباق لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لتثبيت الخلايا. بعد ذلك، اغسل بـ 100 µL لكل بئر من 1%B-S-A-P-B-S وحضن الخلايا لمدة 30 دقيقة إضافية لغرض الحجب. بمجرد حجب الخلايا، أضف 50 µL لكل بئر من الجسم المضاد الأولي المضاد للفيروسات M two المخفف بنسبة 1:1000، وحضن الأطباق لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة لصبغ أي بروتين فيروسي موجود. بعد الحضن، اغسل الخلايا ثلاث مرات بـ 1%B-S-A-P-B-S وحضنها بـ 100 µL لكل بئر من الجسم المضاد الثانوي المقترن بصبغة الأشعة تحت الحمراء بتخفيف 1:200 لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. وبمجرد صبغ الخلايا، اغسلها ثلاث مرات كما سبق.

بعد ذلك، ضع الأطباق على منصة الزجاج القارئة في ماسح الأشعة تحت الحمراء Licor Odyssey. اختر إعداد طبق 96 بئرًا في القارئ باستخدام برنامج Licor Odyssey. حدد آبار التحكم السلبية الفارغة، ثم قم بقياس كمية الفلورة من الطبق بأكمله.

استخدم أداة الأشكال التلقائية لرسم المنطقة المحددة أو ROI في منتصف بئر الاختبار. سنستخدم المنطقة المحددة من بئر تحكم سلبي لتعيين قيمة الفلورية المرجعية للمقايسة، ثم قم بوضع خطي التقاطع المتقابلين اللذين يوفرهما برنامج Odyssey داخل المنطقة المحددة لقياس شدة الفلورية عبر البئر.

بعد ذلك، قم بمسح اللوح باستخدام قناة 780 nanometer للكشف و680 nanometer كطول موجي مرجعي. وبمجرد تفعيل أمر القراءة، سيتم قياس شدة الفلورة على فترات منتظمة ضمن منطقة الاهتمام (ROI)، ومن ثم يتم دمج نقاط البيانات التي تم جمعها.

سيحدد مضاعف الانحراف المعياري مستوى الإشارة فوق الخط القاعدي التي سيتم تضمينها في منطقة الاهتمام (ROI)؛ تأكد من اختيار خيار الكثافة المتكاملة (integrated intensity) لإجراء الحسابات، حيث أنها تمثل صافي حجم البكسل للمناطق المحددة بغض النظر عن حجمها. سيتم قياس الفلورة الخلفية من ضوابط العدوى الوهمية (mock infected controls) واستخدامها لتقدير الكثافة المتكاملة في آبار الاختبار. وتُستخدم الفلورة بالأشعة تحت الحمراء من الآبار المكررة التي تحتوي على تخفيفات متسلسلة من الفيروس المعاير لإنشاء منحنى قياسي.

يمكن بعد ذلك استخدام منحنى القياس لتحديد عيارات سائل غسيل القصبات والأسناخ (BAL) من الفئران المصابة. في هذه التجربة، لوحظت زيادة كبيرة في الحمل الفيروسي في اليومين الثاني والرابع. وقد تم التخلص من الفيروس بعد العدوى بحلول اليوم 10 كما هو موضح هنا.

ترتبط عيارات الفيروسات المقاسة باستخدام هذا المقايسة ارتباطاً وثيقاً بفقدان وزن الفئران بعد الإصابة. كما يمكن تطبيق هذه التقنية على العينات البشرية. يظهر هنا قياس كمي لفيروس H1N1 من مسحة أنف بشرية.

يبلغ حد الكشف هنا 10³ TCID أو الجرعة المعدية للمزارع النسيجية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية تقدير عيار فيروس الإنفلونزا باستخدام المقايسة القائمة على الصبغة بالأشعة تحت الحمراء. يعد العرض المرئي لهذه التقنية أمراً بالغ الأهمية لأن استخدام جهاز التصوير "corp imager" قد يكون صعباً، وهذا سيساعد في تبسيط وتوضيح طرقنا لقياس عيارات الفيروسات في طبق يحتوي على 96 أو 384 بئراً.

وأخيراً، لا تنسَ أن العمل مع الفيروسات قد يكون خطيراً للغاية، لذا يجب دائماً اتخاذ التدابير الوقائية مثل استخدام معدات الوقاية الشخصية عند تنفيذ هذا الإجراء.