كفاءة اشتقاق أسلاف الإنسان متعلق بالخلايا العصبية والخلايا العصبية من افرة القوة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية التعريفي مع جزيء صغير

الهدف العام من التجربة التالية هو اشتقاق نسل عصبي بشكل مباشر وحصري من خلايا جذعية جنينية بشرية متعددة القدرات باستخدام التحريض بالجزيئات الصغيرة. ويتم تحقيق ذلك عن طريق إضافة حمض الريتينويك إلى خلايا غير متمايزة يتم الحفاظ عليها في ظروف محددة. بعد ذلك، تستمر عملية التمايز عن طريق فصل الخلايا في مزرعة تعليق حيث تشكل تجمعات خلوية عائمة تسمى الأرومات العصبية.

إذا سُمح للأرومات العصبية بالالتصاق بـ طبق زراعة الأنسجة في وسط التمايز العصبي، فإنها تكتسب خصائص العصبونات الناضجة. وفي النهاية، يمكن استخدام التألق المناعي والفك الالتفافي أو المجهر البؤري لإظهار تأثير العلاج بحمض الريتينويك على المورفولوجيا والتعبير عن المؤشرات في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المعالجة. وفي التقنيات الأخرى، يتبنى جزء صغير فقط من الخلايا النمط الظاهري العصبي، بينما تسمح طريقتنا بتحفيز فعال ومنضبط جيداً للخلايا الجذعية الجنينية البشرية متعددة القدرات حصرياً نحو السلالة العصبية من خلال التوفير البسيط للجزيئات الصغيرة.

هناك بعض الخطوات التي يجب توخي الحذر عندها عند تحضير المحاليل القياسية. احرص على إذابة الـ matrigel والـ human laminin ببطء من درجة حرارة -80 °C إلى 4 °C طوال الليل، مع تخزين الأوساط الغذائية عند 4 °C، والحرص دائماً على تدفئة الأوساط الغذائية حتى 37 °C قبل الاستخدام. كذلك، عند تحضير أوساط human ESL، تُضاف بعض المكملات مباشرة قبل الاستخدام.

وتشمل هذه المواد BFGF، وحمض ascorbic acid، والأنسولين البشري النشط في A، وtransferrin. بعد ذلك، قم بتحضير محاليل العمل من matra gel أو laminin البشري مباشرة قبل طلاء الأطباق. يتم تحضين الأطباق عند 37 °C في 5% carbon dioxide بعد تجهيز أطباق زراعة الأنسجة المطلية مسبقاً بالجيلاتين.

يمكن استبدال الجيلاتين بمحلول ماتريجيل (matrigel) أو محلول اللامينين الشغال. قم بطلاء هذه الأطباق عن طريق تحضينها طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. ابدأ بالسماح لمستعمرات خلايا ES البشرية بالنمو لمدة تتراوح من خمسة إلى سبعة أيام، ثم استعد لعملية التقسيم.

اختر المستعمرات التي تحتوي على أكثر من 75% من خلايا ES البشرية غير المتمايزة، والتي عادة ما تكون معتمة قليلاً ذات حواف محددة ومكونة من خلايا متراكمة. يظهر مؤشر بدء التمايز عادةً في المستعمرات البيضاء التي تحتوي غالباً على خلايا متمايزة، بينما تظهر المستعمرات التي تحتوي في الغالب على خلايا متمايزة شفافة. لا تختر المستعمرات البيضاء أو الشفافة.

ارفع الأطباق مقابل الضوء واستخدم قلماً لتحديد مستعمرات الخلايا شبه الشفافة الموجودة في قاع الأطباق من خلال رسم خطوط حول حدودها. استخدم حافة رأس ماصة P two معقمة لفصل طبقة الخلايا الليفية المحيطة عن مستعمرة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (human ES cell). بعد ذلك، قم بإزالة الخلايا الليفية المحيطة وكذلك إزالة جميع الأجزاء المتمايزة من المستعمرة.

الآن، قم بشفط الوسط القديم الذي يحتوي على الخلايا المتمايزة المنفصلة. بعد ذلك، اغسل الخلايا غير المتمايزة في كل بئر مرة واحدة باستخدام وسط خلايا E es البشرية الخالي من BFGF، ثم أضف ثلاثة ملليلترات من وسط ESL البشري الطازج الذي يحتوي على B-F-G-F-B-F-G-F؛ حيث يُضاف B-F-G-F-B-F-G-F إلى الوسط الطازج مباشرة قبل الاستخدام. الآن، استخدم رأس ماصة P two معقم لتقطيع المستعمرات إلى قطع صغيرة وفصلها عن الطبق.

انقل قطع المستعمرات المنفصلة مع أوساطها الغذائية إلى أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter. ثم اسحب 1 milliliter إضافي من الوسط الغذائي كغسيل لكل بئر.

الخلايا الآن جاهزة لمزيد من التمايز باستخدام الجزيئات الصغيرة. ابدأ بتدفئة الأطباق المطلية حديثاً إلى 37 درجة مئوية. اسحب محلول الطلاء من الأطباق وأضف مقدار 4 mL من الوسط الذي يحتوي على قطع المستعمرات إلى كل بئر، ثم انقل الأطباق بلطف إلى الحاضنة دون رجّها.

لا تقم بتحريك الأطباق للسماح للخلايا بالاستقرار. وبعد استقرار الخلايا لمدة ثلاثة أيام، قم بتحضير وسط غذائي جديد يحتوي على omic acid. بعد ذلك، قم بإزالة معظم الوسط القديم، مع ترك كمية كافية فقط من الوسط لضمان بقاء الخلايا مغمورة.

يجب عدم السماح للخلايا بالجفاف في كل بئر. أضف 4 mL من وسط زراعة خلايا ES البشرية الطازج المحتوي على BFGF وحمض الريتينوئيك. استبدل الوسط كل يومين واترك مستعمرات خلايا ES البشرية المعالجة بحمض الريتينوئيك لتنمو.

بعد مرور سبعة أو ثمانية أيام، ستكون الخلايا قد خضعت لتغيرات شكلية وتحولت إلى خلايا متمايزة كبيرة. بعد ذلك، ابدأ في تحضير مزرعة خلايا معلقة؛ وللبدء في إنشاء المزرعة المعلقة، قم بفصل مستعمرات ESL عن الخلايا التي تمايزت تلقائياً وهاجرت للخارج لتشكل طبقة ليفية. استخدم التقنية المذكورة سابقاً باستخدام طرف ماصة معقم، ثم قم بشفط الوسط القديم الذي يحتوي على الخلايا الليفية المنفصلة والعائمة.

اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام وسط HESC ثم أعد تعليقها في ثلاثة ملليلتر من وسط HESC. والآن، باستخدام طرف ماصة P2 معقم، قطع المستعمرات إلى قطع صغيرة وافصلها عن الطبق.

اسحب الوسط الذي يحتوي على المستعمرات المنفصلة وانقله إلى أنبوب مخروطي واحد سعة 50 milliliter. اشطف الآبار باستخدام 1 milliliter من الوسط وأضف سائل الشطف إلى المجمع. بعد ذلك، وزع 4 milliliter من الخلايا المجمعة في كل بئر من أطباق six well ذات الالتصاق المنخفض للغاية لمدة تتراوح من أربعة إلى خمسة أيام، مع حفظ الطبق في الحاضنة.

خلال هذه الفترة، ستتشكل تجمعات خلوية عائمة أو أرومات عصبية لتعزيز تطور الأرومة العصبية إلى نمط ظاهري عصبي أكثر نضجاً. اسحب الوسط الذي يحتوي عليها إلى أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter. ثم قم بطرد الخلايا مركزياً بسرعة 1,400 RPM لمدة خمس دقائق.

قم بسحب الوسط القديم، ووزن أكبر كمية ممكنة منه، ثم أضف كمية مساوية من وسط NSC الطازج الذي يحتوي على VEGF N NT three وBDNF. امزج الخلايا في معلق عن طريق السحب بالماصة، ثم وزع 4 mL من المعلق في كل بئر من أطباق زراعة الأنسجة ذات الستة آبار، وانقل الأطباق إلى حاضنة مرطبة عند درجة حرارة 37 °C.

ستلتصق الخلايا العصبية البدائية (neuroblasts) بأطباق الزرع طوال الليل لإجراء زرع ثلاثي الأبعاد باستخدام Matrigel أو رقائق بشرية مضافة إلى معلق الخلايا العصبية البدائية. وسوف تتبلمر المصفوفة ثلاثية الأبعاد عند درجة حرارة 37 °C. استبدل الوسط الغذائي كل يومين.

في غضون أسبوعين، ستظهر شبكات واسعة من الخلايا العصبية الحاملة للمحاور العصبية والخلايا الصبغية، مما يشير إلى أن حمض الريتينويك كافٍ لتحفيز خلايا ES البشرية المحفوظة في نظام استزراع محدد للانتقال من الحالة متعددة القدرات حصرياً إلى النمط الظاهري العصبي البشروي. وعند تعريض خلايا ES البشرية غير المتمايزة إلى حمض الريتينويك، خضعت جميع الخلايا داخل المستعمرة لتغيرات مورفولوجية تحولت بموجبها إلى خلايا متمايزة كبيرة توقفت عن التعبير عن OCT four، وهو المؤشر المرتبط بتعدد القدرات. كما بدأت الخلايا في التعبير عن مؤشرات مختلفة مرتبطة بالأديم الظاهر العصبي مثل HNK one a وP two وTRKC.

استمرت هذه الخلايا المتمايزة الكبيرة في التكاثر وزادت المستعمرات في الحجم مع تعبير تلقائي عن مؤشر الخلايا العصبية المبكر beta three tubulin. وبدأ مؤشر الخلايا العصبية الأكثر نضجاً map two في الظهور في مناطق المستعمرات التي تراكمت فيها الخلايا. وبالتزامن مع ظهور الخلايا ذات الأصل الأديم الظاهر العصبي، انتقل عامل النسخ المحدد للخلايا العصبية NER one، المرتبط بتمايز الخلايا العصبية الدوبامينية وتنشيط جين tyrosine hydroxylase، إلى النواة.

بعد الفصل، شكلت خلايا الجنين البشرية (ES cells) المعالجة بحمض الريتينويك أرومات عصبية في مزرعة معلقة عند إزالة عامل نمو الأرومة الليفية الأساسي (basic FGF)، وبعد السماح للأرومات العصبية بالالتصاق بطبق زراعة الأنسجة، بدأت تظهر شبكات واسعة من الخلايا العصبية الحاملة للمحاوير والخلايا الصبغية، النموذجية للجهاز العصبي المركزي (CNS)، مع زيادة كبيرة في الكفاءة، وكان من الممكن زراعتها على مدى ثلاثة أشهر. وقد عبرت هذه الخلايا العصبية المشتقة من خلايا الجنين البشرية عن beta three tubulin مقارنة بالتمايز العفوي متعدد السلالات للخلايا التي لم تخضع لمعالجات حمض الريتينويك، كما عبرت بشكل مشترك عن map two. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن استخدامها لتوليد سلف عصبي وخلايا عصبية بشكل موحد من خلايا جذعية جنينية بشرية متعددة القدرات في غضون أربعة أسابيع تقريبًا إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.

لا تنسَ أن العمل مع الخلايا البشرية قد يكون شديد الخطورة، ويجب دائمًا اتخاذ الاحتياطات اللازمة، مثل التأكد من خلو الخطوط الخلوية من المسببات المرضية والميكوبلازما، قبل تنفيذ هذا الإجراء.