اشتقاق، توسعة، المحافظة على التبريد وتوصيف خلايا الدماغ البطانية الدقيقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من الإنسان

BMECs المتولدة من iPSC نماذج تجريبية جديدة لدراسة وظيفة الحاجز الدموي في الدماغ والخلل الوظيفي. لقد استخدمنا هذا البروتوكول لفحص ما إذا كانت BMECs تحتفظ بخصائص الحاجز الخاصة بها بعد التمدد والحفظ بالتبريد. تتيح هذه التقنية توليد BMECs الخاصة بالأمراض من المرضى الذين يعانون من اضطرابات يلعب فيها اضطراب الحاجز الدموي الدماغي دورا في الفيزيولوجيا المرضية للمرض.

للحث على تمايز BMEC من iPSCs البشرية, غسل ثقافة iPSC المتقاربة مع DPBS مرة واحدة قبل احتضان الخلايا بالحجم المناسب من EDTA الأنزيمي لمدة خمس دقائق تقريبا عند 37 درجة مئوية. عندما يتم الحصول على تعليق خلية واحدة ، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات في حجم مناسب من وسط الخلايا الجذعية مكملا ب 10 مثبطات ميكرومولار ROCK للعد. خفف الخلايا إلى 1.56 في 10 إلى الخلايا الرابعة لكل تركيز سنتيمتر مكعب وزرع ملليلترين من الخلايا في آبار فردية ذات قاع مسطح من ستة آبار.

بعد 24 ساعة في حاضنة زراعة الخلايا ، استبدل المادة الطافية في كل بئر بوسط E6 وأعد اللوحة إلى الحاضنة لمدة أربعة أيام أخرى. لتنقية BMECs المشتقة من iPSC ، قم بتغطية ألواح الزراعة الفرعية بالحجم المناسب من محلول الكولاجين الوردي والفيبرونيكتين المحضر حديثا لكل بئر واحتضان الألواح لمدة ساعتين على الأقل عند 37 درجة مئوية. في اليوم السادس من التمايز ، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الكريات في الحجم المناسب من وسط مصل البطاني البشري الطازج المكمل ب B27 ، وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسية ، وحمض الريتينويك.

لتحليل TEER ، قم بوضع الخلايا المتمايزة في كل بئر من الكولاجين والفيبرونيكتين المطلي بلوحة مصفاة 12 من الوسائل. لتحليل نشاط ناقل التدفق ، قم بوضع الخلايا في كل بئر من الكولاجين والفيبرونيكتين المطلي بلوحة قاع مسطحة 24 بئرا. بعد 24 ساعة من الزراعة الفرعية ، استبدل المادة الطافية في كل بئر بوسط خال من مصل البطان البشري الطازج المكمل فقط بمكمل B27.

لقياس خصائص الحاجز الدموي الدماغي ل BMECs باستخدام TEER ، اشحن أداة TEER طوال الليل وامسح الجهاز وأقطاب عود تناول الطعام برفق بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل وضعها في غطاء الأمان. قم بتشغيل الطاقة ومعايرة مقياس أوم وفقا لمواصفات الشركة المصنعة. قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية واشطفها مرة واحدة باستخدام 70٪ من الإيثانول ومرة واحدة باستخدام DPBS.

ضع الطرف الأقصر من القطب في الغرفة غير النمطية للملحق والطرف الأطول في الغرفة القاعدية الجانبية لبئر فارغ. بعد قياس استجابة التحكم السلبية ، اشطف الأقطاب الكهربائية بسرعة كما هو موضح وقم بقياس البئر التجريبي الأول. بعد تسجيل جميع القياسات ، اشطف أقطاب عود تناول الطعام مرة أخرى ، امسح الأقطاب الكهربائية برفق واتركها تجف في الهواء في غطاء الأمان.

لتقييم نشاط ناقل التدفق للخلايا ، في اليوم الثامن من الاستزراع ، عالج العدد المناسب من الآبار بمحلول مثبط ناقل التدفق 10 ميكرومولار وضعه في حاضنة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة ، عالج الخلايا بمحلول ركيزة ناقل تدفق 10 ميكرومولار لمدة ساعة واحدة في الحاضنة. في نهاية الحضانة ، اغسل كل بئر مرتين ب 500 ميكرولتر من DPBS لكل بئر قبل تحلل الخلايا ب 500 ميكرولتر DPBS مكملة ب 5٪ Triton-X لكل بئر.

بعد خمس دقائق ، استخدم قارئ الصفيحة الدقيقة لقياس تألق الخلايا المحللة عند إثارة 485 نانومتر وانبعاث 530 نانومتر. بالنسبة للآبار غير المستخدمة في مقايسة الناقل ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام DPBS قبل التثبيت باستخدام 4٪ بارافورمالدهيد لكل قياس لنوى الخلية. بعد يوم واحد من الثقافة في E6 متوسط, مورفولوجيا الخلية مماثلة لتلك الموجودة في iPSCs.

في اليوم الرابع, الخلايا متميزة بشكل واضح عن iPSCs وتغطي معظم البئر. يومين من الثقافة في وسط خال من مصل البطان البشري يحفز مظهرا ممدودا ومرصوفا بالحصى في الخلايا. في اليوم الثامن ، تشكل الخلايا الفردية نمطا مرصوفا بالحصى في الغالب.

يمكن إجراء اختبار ينبت لإثبات إمكانات تولد الأوعية الدموية لمركبات BMECs المشتقة من iPSC. هذا يؤدي إلى تطوير هياكل تشبه الأنبوب بعد ثلاثة أيام من علاج عامل النمو. تعبر BMECs المشتقة من iPSC التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول عن بروتينات التوصيل الضيقة المعبر عنها في الخلايا البطانية في الدماغ والرئة والكبد والكلى ، بالإضافة إلى العلامات البطانية الوعائية المعبر عنها عند الحاجز الدموي الدماغي.

كما لوحظ, 48 ساعات بعد الاستزراع الفرعي والتغير المتوسط المشتق من iPSCs BMECs تظهر قيم TEER ضمن النطاق الموصوف ل BMECs المشتقة من iPSC والتي تم زراعتها بشكل مشترك مع الخلايا النجمية الأولية للفئران. كما لوحظ نشاط ناقل التدفق في هذه المرحلة. بعد الحفظ بالتبريد ، تكون قياسات TEER أقل مقارنة ب BMECs المشتقة حديثا.

يكشف تحليل اللطخة الغربية عن انخفاض مستويات علامات التوصيل الضيقة ، مثل occludin ، بينما تظهر كيمياء الخلايا المناعية أنماطا منمشة و / أو مهترئة لبروتينات التوصيل الضيقة. كثافة iPSC عالية جدا أو منخفضة جدا سوف تؤثر على كفاءة التمايز وتؤثر على تطوير خصائص حاجز الدم في الدماغ المناسبة. تتيح هذه الطريقة التحقيق في خصائص الحاجز والإشارات الخلوية ونشاط الناقل باستخدام BMECs الفردية لنمذجة علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية لوظيفة الحاجز الدموي الدماغي.