بناء منخفض الميزانية Axotomy نظام ليزر لدراسة التجديد في أكسون C. ايليجانس

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح كيفية تجميع ومحاذاة نظام الاستئصال بالليزر لدراسة تجدد المحاور العصبية في CL gans. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تثبيت مضخة الليزر، والمستقطب Thompson، ولوحة نصف الموجة، ومرآة التدوير، والبيريسكوب، وقضيب السكك، ومرآة القضيب على لوحة تثبيت (breadboard). وتتمثل الخطوة التالية من الإجراء في محاذاة شعاع الليزر مع الشعاع الخارج من عدسة مكثف المجهر.

بعد ذلك، يتم تركيب عدسة موسع شعاع الليزر ومحاذاتها ووضعها لتركيز شعاع الليزر وجعله عديم التباعد. الخطوة النهائية من الإجراء هي جعل بقعة الاستئصال بالليزر متطابقة مع بؤرة الصورة عن طريق إجراء تعديلات دقيقة. وفي النهاية، يمكن قطع المحاور العصبية التي يبلغ حجمها نصف ميكرون بدقة مع تقليل الضرر الجانبي للأنسجة باستخدام شعاع الليزر المحدود بالحيود عندما يكون محاذاة XY NC غير مثالية.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل ليزر الفيمتو ثانية، في أنها منخفضة التكلفة نسبيًا حيث تبلغ 15,000. كما أنها لا تتطلب صيانة تذكر وتوفر قطعًا دقيقًا جدًا للمحاور العصبية. وبالرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول تجديد المحاور العصبية في ديدان *C. elegans*، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضًا على أنظمة أخرى مثل الذباب، والأسماك المخططة، والفئران، والجهاز العصبي الطرفي، والخلايا في المختبر.

بشكل أساسي، أي خلية تقع ضمن مسافة 30 إلى 50 micrometers من السطح. ابدأ بوضع المكونات على لوحة التوصيل (breadboard) ثم قم بتثبيت عمود المنظار الليزري ودعامات السكك المرتفعة بالبراغي. يستخدم هذا النظام ليزر من الفئة Class three B والذي يمكن أن يسبب ضرراً جسيماً للعينين، لذا يرجى الالتزام بجدية تامة بقواعد السلامة الخاصة بالليزر.

تحدث مع شخص ما في قسم الفيزياء المحلي لديك حول كيفية التعامل مع ليزرات الحزمة الحرة بأمان. احرص دائماً أثناء عملية المحاذاة على ضبط الليزر عند أدنى قدرة. وعندما تنظر من خلال العينات العينية، تأكد من أن الليزر مغلق ميكانيكياً وبأن جهاز الليزر مطفأ.

الآن، قم بتحديد موضع المجهر أولاً، بحيث يكون محاذياً لمحور السكة. ثانياً، قم بمحاذاته مع حزمة الضوء النافذ القادمة من عدسة مكثف المجهر. ثالثاً، قم بمحاذاة كلا طرفي السكة مع حزمة المكثف باستخدام فتحة قابلة للتعديل أو عدسة مثبتة على السكة.

استخدم ميزان تسوية ورافعات مختبرية لضبط ارتفاع السكة قبل المتابعة. تأكد من محاذاة كلا طرفي السكة. الآن، تأكد من أن شعاع الليزر يمر عبر الغدة، ومستقطب Thompson، والصفيحة نصف الموجية، وأنه لا يصطدم بحوافها أثناء الدوران.

ستعمل صفيحة التوهين (halfway plate) على ضبط قدرة الليزر مع تثبيت جميع المكونات على لوحة التركيب (breadboard). قم بتشغيل الليزر، واضبط تردد النبضات على الوضع المستمر 100، ثم خفض القدرة إلى الحد الأدنى باستخدام صفيحة التوهين. استخدم ورقة ملاحظات لاصقة أو ورق تنظيف العدسات لرؤية شعاع الليزر.

الآن، سنقوم برفع شعاع الليزر من لوحة التجارب (breadboard). قم بضبط وتثبيت المرايا ذات التركيب الكينماتيكي بالتسلسل بدءاً من الليزر لرفع الشعاع وصولاً إلى المرآة المثبتة على نهاية السكك المرتفعة. عند الانتهاء، يجب أن يكون شعاع الليزر محاذياً تقريباً لمركز المرايا، ويجب أن تكون المرايا موجهة بزاوية 45 درجة تقريباً بالنسبة لمحور شعاع الليزر قبل محاذاة شعاع الليزر مع شعاع الضوء النافذ للمجهر.

قم بإزالة أو فتح أي مرشحات كثافة متعادلة (ND filters) وفتحات في الوحدة المتوسطة. نبدأ الآن الخطوة الأكثر أهمية لضمان قطع دقيق للمحاور العصبية دون إحداث أضرار جانبية مفرطة. سنقوم بمحاذاة الليزر بدقة في المحاور x و y و Z عند أدنى قدرة لليزر للحصول على أصغر بقعة استئصال.

يمكن رؤية شعاع الليزر وشعاع الضوء النافذ في آن واحد على الورق. ابدأ بوضع الورقة بالقرب من منفذ المجهر. الآن، ابدأ بمحاذاة الليزر باستخدام تعديلات الضبط التقريبي على المرآة الموجودة أعلى البيريسكوب والمرآة الموجودة في نهاية السكة.

ضع ورقة بين عدسة المكثف المحاذية وبرج الشيئية المفتوح. استمر في استخدام الضبط الدقيق لمرآة السكك الحديدية لمحاذاة شعاع الليزر مع مركز شعاع الضوء النافذ الأكبر. الآن، قم بتثبيت المجهر في مكانه باستخدام المشابك.

يمكن العثور على خطوات إضافية حول تقييم محاذاة الليزر في المخطوطة المكتوبة. يجب تركيب موسعات شعاع غاليلي مزدوجة لتوسيع شعاع الليزر البالغ 300 micron بمقدار 33 مرة لملء الفتحة الخلفية للعدسة الشيئية ذات الـ 10 millimeter. ابدأ بتثبيت العدسات الأربع على الحوامل.

بعد ذلك، قم بتثبيت العدسات على السكة بحيث تكون جميعها على نفس المحور البصري وعمودية تماماً على شعاع الليزر. قم بتشغيل الليزر واضبطه على الحد الأدنى من الطاقة وعلى الوضع المستمر. ثم قم بضبط محاذاة الشعاع بشكل تقريبي عبر كل عدسة.

استخدم ورقة لرؤية الشعاع. الآن قم بإيقاف تشغيل الليزر. ضع غالق أمان على الليزر وأبعد المجهر من مسار شعاع الليزر.

أعد تشغيل الليزر وقم بتصوير الحزمة على جدار قريب. استخدم الضبط الدقيق للعدسات لتوسيع الحزمة. بعد ذلك، اضبط المرآتين الأخيرتين المثبتتين حركياً (kinematically mounted) لمحاذاة الحزمة لتشكل دائرة ذات سطوع منتظم عند الموضع التقديري للفتحة الخلفية للعدسة الشيئية.

عاين حجم الحزمة ومدى تجانسها مقابل ورقة. ثم اضبط الحزمة لتحقيق التقارب الصفري من خلال ملاحظة كيفية تغير حجم الحزمة عند تحريك الورقة بعيداً عن العدسة. أطفئ الليزر وقم بتفعيل الغالق الميكانيكي.

قم بإرجاع المجهر إلى مسار شعاع الليزر باستخدام المشابك الثابتة لتحديد المحاذاة الصحيحة. أعد تركيب المشابك على الجانب الحر من المجهر، ولكن لا تقم بإحكام ربطها. الآن قم بتشغيل الليزر.

قم بإزالة غالق الأمان وتدوير برج العدسات الشيئية إلى وضع مفتوح باستخدام ورقة على المنصة، ويجب أن يكون شعاع الليزر الموسع والمتجانس مرئياً وهو يتمركز مع شعاع الضوء النافذ من المكثف. إذا لم يكن متمركزاً، فقم بتمركز الأشعة عن طريق فك مشابك المجهر وتحريك المجهر برفق. الآن، قم بتفعيل غالق الأمان واضبط الليزر على وضع التشغيل (trigger mode).

قم بتدوير العدسة الشيئية بقوة تكبير 60 مرة في مكانها. الآن، التقط صورة لخدوش السطح على شريحة الهدف. قم بإزالة غالق الأمان، وفعّل ليزر الاستئصال، ثم اضبط قدرة الليزر للحصول على أدنى بقعة استئصال.

يجب أن تكون البقعة دائرية وضمن نطاق 5 إلى 10 ميكرون من مركز الصورة، وهو مركز بقعة الاستئصال. وباستخدام الضبط الدقيق لمرآة السكة المثبتة حركياً للحفاظ على تمركز البقعة وتوحيد شكل الحزمة، سيكون من الضروري ضبط مرآة السكة والمرآة العلوية للمنظار بشكل تكراري. قم بتقييم بؤرة Z لليزر عن طريق تحريك البؤرة للأعلى وللأسفل بشكل منهجي بخطوات قدرها ميكرون واحد، مع تشغيل ليزر الاستئصال عند كل خطوة.

إذا تم توسيع الحزمة ومحاذاتها بشكل صحيح ومع ضبط التقارب بدقة، فيجب أن يكون الاستئصال في أقصى درجاته عند بؤرة الصورة، ويكون ضعيفاً أو معدوماً على مسافة ميكرون واحد فوق أو تحت البؤرة. أما إذا كانت نقطة الاستئصال القصوى تقع فوق أو تحت بؤرة الصورة، فيتم إجراء التعديلات النهائية على بؤرة Z للحزمة الموسعة عن طريق تحريك العدسة L three للتلسكوب الغاليلِي حتى يتطابق الاستئصال بالليزر مع بؤرة الصورة. تم تثبيت الديدان الخيطية على شريحة مخصصة وتم استئصال المحاور العصبية باستخدام نظام Laser exo somy الذي تم بناؤه، وكان التصوير بالفاصل الزمني لتجدد المحور العصبي قوياً للغاية.

باستخدام منصة آلية، أمكن قطع وتصوير خمسة محاور عصبية في خمسة حيوانات مختلفة بشكل روتيني ودقيق على شريحة واحدة. وكان وقت تصوير المحاور العصبية هو العامل المحدد.

أنتجت حوالي 10% من التجارب مقاطع فيديو بنظام التصوير الزمني (time-lapse) عالية الجودة. أما التجارب المتبقية فقد وفرت جميعها بيانات جيدة، ولكنها كانت أقل جاذبية من الناحية الجمالية بسبب حركات ارتجافية صغيرة للدودة بدأت عموماً بعد خمس إلى ثماني ساعات من التثبيت. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم دائماً تقييم محاذاة الليزر بدقة في المحاور x وy وZ.

تتمثل المشكلة الأكثر شيوعاً التي يواجهها الأشخاص عند محاولة قطع المحور العصبي في حدوث ضرر جانبي أو عدم القدرة التامة على قطع المحاور، ويعود ذلك دائماً تقريباً إلى عدم محاذاة الليزر بشكل صحيح. سيتيح لك نظام الاستئصال بالليزر هذا وتقنية تصور تجدد المحاور العصبية في c Agains إجراء اختبار دوري لتأثير أي طفرة جينية على تجدد المحاور العصبية. NCL Agains.