بناء هيدروجيل الكولاجين لتسليم الشيتوزان الجذعية المجهرية الخلية محملة

يقدم هذا البروتوكول استراتيجية مخبرية لنقل الخلايا الجذعية من الكريات الدقيقة للشيتوزان إلى سِقالة من هلام الكولاجين، ثم حصادها واستزراعها. يتم بعد ذلك استحلاب الخلايا الجذعية الدهنية الأولية واستعادة تحضير من الكريات الدقيقة للشيتوزان. بعد ذلك، يتم استزراع الخلايا الجذعية على الكريات الدقيقة للشيتوزان وزراعتها في inserts لطبق استزراع غشائي بحجم مسام ثمانية ميكرون لإنتاج CSM محمل بـ CS، وأخيرًا يتم خلط نظام توصيل الكريات الدقيقة مع سِقالة ثلاثية الأبعاد من هلام الكولاجين.

في نهاية المطاف، يوفر نظام CSM هذا إمكانيات للاستخدام في الطب التجديدي وتوصيل الأدوية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل حقن الخلايا أو التغليف الدقيق، في قدرة الخلايا على الالتصاق بمادة حاملة والبقاء بعد التطبيق الأولي. وبشكل عام، سيواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأن الكرات الدقيقة من esan تحمل شحنة استاتيكية متأصلة.

سيكون تحميل الخلايا فوق سرير من الكرات الدقيقة أمراً صعباً دون إزعاجها. يتم استئصال وغسل الأنسجة الدهنية حول العجان والجلدية من لفافة، ثم تُفرم الأنسجة، ويُنقل جرام واحد إلى جرامين منها إلى 25 milliliters من HBSS المحتوي على 1%FBS. بعد الطرد المركزي، تُجمع طبقة الأنسجة الدهنية العائمة في قارورة إرلنماير سعة 125 milliliter.

أضف 25 milliliters من الكولاجينيز من النوع الثاني (collagenase type two) واحضن التفاعل على هزاز مداري. الآن، قم بإزالة الجزء السائل الموجود أسفل طبقة الزيت والدهون بعناية، وقم بترشيحه بالتتابع عبر مرشحات شبكية من النايلون بحجم 170 microns. ثم قم بحصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي بعد غسلها مرتين باستخدام 25 milliliters.

إعادة التعليق في HBSS، قم بتعليق الراسب في 30 milliliters من وسط نمو mesen pro المدعم. قسم الخلايا الجذعية المشتقة من النسيج الدهني المنقاة إلى قارورتي زراعة T 75 وقم بتكثير تحضير A SC في حاضنة مرطبة تحتوي على 5% carbon dioxide عند درجة حرارة 37 degrees Celsius. يعد بروتوكول CSM هذا عملية استحلاب مائي في زيت تعتمد على تقنية ionic coer.

قم باستحلاب ستة مللي لتر من محلول مائي من الشيتوزان في 100 مللي لتر من خليط الطور الزيتي باستخدام التقليب العلوي والمغناطيسي في آن واحد وفي اتجاهين متعاكسين لمدة ساعة واحدة للحصول على مستحلب مستقر من الماء والزيت، ثم أضف 1.5 مللي لتر من هيدروكسيد البوتاسيوم بتركيز 1% في n octal كل 15 دقيقة لمدة أربع ساعات. بعد اكتمال تفاعل التشابك الأيوني، قم بسكب الطور الزيتي ببطء وأضف الكرات فوراً إلى 100 مللي لتر من الأسيتون. اغسل الكرات بالأسيتون حتى يتم إزالة الطور الزيتي تماماً.

بعد ذلك، يتم تجفيف الكرات المستخلصة في الفراغ. تُجفف العينات ثم يُحدد متوسط حجم جسيمات CSM ومساحة السطح لكل مليجرام والحجم المكعبي للوحدة باستخدام محلل حجم الجسيمات. يتم المضي قدماً في غسل CSM ثلاث مرات بالماء المعقم لإزالة الأملاح المتبقية.

الآن قم بتعقيم تحضير وسط CSM بالكحول المطلق لاستخدامه في تجارب الخلايا؛ في أنبوب زجاجي سعة 50 milliliter، امزج خمسة milligrams من الكريات الدقيقة مع one milliliter من محلول TNBS بتركيز 0.5% وحضن المزيج لمدة أربع ساعات عند 40 °C. ثم أضف ثلاثة milliliters من حمض الهيدروكلوريك بتركيز 6 normal وحضنه عند 60 °C لمدة ساعتين. بعد تبريد العينات إلى درجة حرارة الغرفة، أضف خمسة milliliters من الماء منزوع الأيونات و10 milliliters من Ethel Ether.

لاستخلاص TNBS الحر، يتم سحب عينة بحجم 5 mL من الطور المائي وتسخينها إلى 40 °C في حمام مائي لمدة 15 دقيقة لتبخير أي إيثر متبقٍ بعد التبريد إلى درجة الحرارة المحيطة. تُخفف العينة بإضافة 15 mL من الماء، ثم تُقاس الامتصاصية للكرات الدقيقة من الشيتوزان المحضرة عند 345 nm باستخدام مقياس الطيف الضوئي، مع استخدام TNBS كمحلول بياض (blank).

قم أيضاً بقياس كمية الشيتوزان المستخدمة في تحضير الـ CSM. الآن، احسب عدد مجموعات الأمين الحرة في الـ CSM بالنسبة للعدد الإجمالي لمجموعات الأمين في الشيتوزان. قم بموازنة خمسة مليغرام من الـ CSM المعقم في محلول HBSS معقم طوال الليل.

انقل CSM إلى غشاء إدراج بمسام قطرها ثمانية ميكرون مخصص لأطباق زراعة ذات 24 بئرًا. بعد استقرار CSM، قم بسحب HBSS بعناية. الآن أضف 300 microliters من وسط النمو إلى داخل الإدراج، و700 microliters من وسط النمو إلى خارج الإدراج.Resus.

قم بتعليق الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية في 200 µL من وسط النمو، ثم استزرعها فوق الـ CSM داخل طبق الزرع. أدخلها في حاضنة رطبة تحتوي على 5% carbon dioxide عند 37 °C لمدة 24 ساعة. انقل الـ CSM المحمل بالخلايا الجذعية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم دون تحريك الخلايا التي هاجرت إلى غشاء الإدخال.

قم الآن بإزالة الوسط المتبقي وإضافة 250 µL من وسط نمو جديد إلى كل أنبوب. أضف 25 µL من محلول MTT بتركيز 5 mg/mL واحضن العينات لمدة أربع ساعات. أزل الأوساط وأضف 250 µL من dimethyl sulf oxide مع الرج باستخدام جهاز vortex لإذابة معقد الفورمازان، ثم قم بطرد مركزي لـ CSM عند 2,700 G لمدة خمس دقائق.

قس امتصاصية الراشح عند 570 نانومتر باستخدام 630 نانومتر كمرجع. انتقل بعد ذلك إلى تحديد عدد الخلايا المرتبط بـ CSM بالنسبة لقيمة الامتصاصية التي تم الحصول عليها من أعداد معروفة من A SC الحية. اخلط خمسة مليغرام من CSM محمل بـ A SC مع 7.5 مليغرام لكل مليليتر من كولاجين من النوع الأول المستخلص من الجرذان.

وتر الذيل، اضبط الرقم الهيدروجيني pH إلى 6.8 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم عياريين وصب الخليط في طبق زراعة. أدخل العينة لتقوم بالتلييف ثم انقلها إلى طبق به 12 بئراً واحضنها لمدة 30 دقيقة. استمر في تجديد الوسط لجلول collagen A-S-C-C-S-M يوماً بعد يوم طوال فترة الحضن.

كما يتم رصد تحرر وهجرة الخلايا من مساحيق الشيتوزان الدقيقة (CSM) إلى الهلام باستخدام تقنيات المجهر القياسية. يصف المثال التالي الاستراتيجية المخبرية لنقل الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية من مساحيق الشيتوزان الدقيقة إلى ساند من هلام الكولاجين. وتشير صور المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) والمجهر الإلكتروني النافذ (TEM) إلى تحضير مساحيق شيتوزان دقيقة مسامية وذات حجم موحد.

يشير تحضين الكرات المجهرية مع الخلايا الجذعية الأولية المشتقة من الأنسجة الدهنية إلى وجود 4,000 خلية لكل مليجرام من CSM calcium am. ويظهر صبغ خلية SC انتشارها فوق CSM مع تمدد القدميات الخيطية داخل الشقوق المسامية للكرة المجهرية. وعند خلط CSM المحملة بالخلايا مع هلام الكولاجين، تهاجر الخلايا إلى داخل الهلام ويمكن تتبعها بمرور الوقت.

تمتد تداعيات هذه التقنية بشكل مباشر نحو علاج فقدان الأنسجة الشديد والمزمن. ومع ذلك، فإن نظام العلاج هذا يمتلك إمكانات أكبر بكثير نظراً لمرونته في التكامل مع مجموعة متنوعة من الخلايا و/أو المواد الحيوية المستخدمة لعلاج مستويات مختلفة من فقدان الأنسجة الرخوة وأنسجة القلب. ومن المحتمل أن توفر هذه الطريقة رؤى حول عملية إيصال الخلايا المضيفة.

ويمكن تطبيقه أيضاً على أنظمة أخرى مثل المواد القابلة للحقن، وإيصال العقاقير العلاجية، وتطوير أنظمة هجينة لإيصال الخلايا والعقاقير العلاجية معاً.