موازية لوحة الدائرة التدفق المستمر وحلبة لتقييم تدفق الخلايا الاصلية تحت تدفق رقائقي غشائي إجهاد القص

الهدف العام من هذا المقال المرئي هو وصف تقنية لإخضاع الخلايا الملتصقة لظروف التدفق الصفائحي وتقييم الاستجابة لإجهادات قص سائلة يمكن قياسها كمياً بشكل جيد. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تجميع دائرة التدفق بدون غرفة التدفق. تتضمن الدائرة خزان النبض، ومخمد النبضات، وأنابيب صلبة، وأنابيب مرنة، وصمامات توقف رباعية الاتجاهات ومحولات لور متصلة، بالإضافة إلى مرشح هواء.

تتمثل الخطوة التالية في ملء الدائرة بالسائل المطلوب، مثل الوسط الخلوي تحت ظروف معقمة، ثم تشغيل المضخة لملء مخمد النبضات وتفريغ الأنابيب من الهواء. يلي ذلك إدخال الشريحة الحاملة للخلايا في اللوح السفلي لغرفة التدفق. والخطوة النهائية من الإجراء هي التجميع الكامل لدائرة التدفق مع دمج غرفة التدفق في المسار.

في نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج تُظهر اصطفاف الخلايا السلفية البطانية المحددة بفلورسنت تحت تأثير إجهاد القص السائلي عبر الغرفة الشفافة باستخدام مجهر فلورسنت لدراسة السلوك الوظيفي للخلايا. فغالباً ما يكون من الضروري محاكاة الفسيولوجيا الحيوية داخل الجسم من خلال تعريض الخلايا لإجهاد القص السائلي. لقد قمنا بتصميم غرفة تدفق ذات لوحين متوازيين ودائرة تدفق مستمر، مما يتيح لنا دراسة الخلايا تحت ظروف التدفق ومراقبتها من خلال الغرفة الشفافة.

يمكن أن تعمل هذه التقنية كأداة بحثية قيمة في مجالي الطب والهندسة. حيث تتيح غرفة التدفق الخاصة بنا تصور الخلايا تحت التدفق بشكل متقطع أو في الوقت الفعلي باستخدام مجهر قائم أو مقلوب. علاوة على ذلك، فإن تصميم الدكتور Ach Nick يتيح للباحثين تصوير الخلايا على أسطح شفافة أو عاتمة للأشعة باستخدام عدسات المجهر القياسية.

علاوة على ذلك، يمكن استخدامه كأداة مهمة في أبحاث الصيدلة لدراسة تأثير العقاقير على الخلايا تحت ظروف التدفق. ويعد التصور المرئي للإعداد أمراً بالغ الأهمية لأن العديد من الخطوات يصعب إتقانها من خلال قراءة البروتوكول وحده. سأقدم تعليمات خطوة بخطوة حول كيفية إعداد غرفة التدفق ودائرة التدفق المستخدمة عادةً في مختبر Dr.Ock Next لتجميع دائرة التدفق.

ابدأ بتوصيل قطعة من الأنابيب الصلبة بطول 36 بوصة من أحد طرفي مخمد النبضات إلى الطرف الآخر. قم بتوصيل قطعة من الأنابيب المرنة بطول 18 بوصة. ضع محول لور ذكر بمقاس ثمن بوصة عند نهاية قسم الأنابيب المرنة الذي يبلغ طوله 18 بوصة.

قم بتوصيل الوصلة الذكرية بمحول وصلة أنثوية قياس 1/8 بوصة. قم بتثبيت الوصلة الأنثوية في قطعة جديدة من الأنابيب المرنة بطول 18 بوصة. قم بثقب ثلاثة ثقوب في غطاء وعاء زجاجي سعة 250 milliliter.

من أجل تركيب الأنابيب، أدخل قطعة بطول 1.5 inch من الأنبوب المرن في إحدى الفتحات لتكون بمثابة فتحة تهوية. أدخل النهايات الحرة للأنبوبين الصلب والمرن من خلال الفتحتين الأخريين في الغطاء إلى داخل الزجاجة الزجاجية سعة 250 milliliter، والتي ستعمل كخزان.

تأكد من وصول الأنبوب الصلب إلى قاع الخزان. إن الحفاظ على التعقيم طوال عملية إعداد الدائرة أمر بالغ الأهمية لنجاح هذا الإجراء؛ لذا يجب تعقيم جميع الأجزاء، ويجب عليك ارتداء قفازات معقمة طوال الوقت.

بالإضافة إلى الأجزاء المجمعة، يجب تعقيم هذه القطع: غرفة تدفق واحدة كاملة، وقطع من الأنابيب المرنة بطول 3 في 2 بوصة، ومحول لوك (lure adapter) واحد ذكر وآخر أنثى بمقاس 1/8 بوصة، وأربعة براغي ذات رأس مسطح بمقاس 1/2 بوصة، و6 براغي ذات رأس مسطح بمقاس 5/16 بوصة، وثمانية براغي بمقاس 30 ثانية بوصة لكل بوصة، وملقط واحد، وشريحة زجاجية واحدة، ومنشفتين، على أن يتم التعقيم جميعاً بالبخار.

التعقيم بجهاز الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. ضع غرفة تدفق دائرة التدفق، وصمامات إيقاف رباعية الاتجاه عدد أربعة، وصمامات إيقاف أحادية الاتجاه عدد اثنين، وجميع الأجزاء المعقمة على هذا المجال المعقم. أثناء ارتداء قفازات معقمة، قم بتوصيل صمامي الإيقاف رباعيي الاتجاه.

ضع الأغطية على منافذ العينات المفتوحة. افصل مهيئات الجذب الذكرية والأنثوية التي تربط قطاعي الأنابيب المرنة في دائرة التدفق، ثم أدخل صمامات الغلق المتصلة. قم بتوصيل الأنبوب المرن المدرج في الخزان بمحقنة سعة 30 milliliter، ثم قم بإزالة مكبس المحقنة.

املأ الزجاجة بـ 125 milliliters من وسط EPC. أعد توصيل الأنبوب المرن بصمام الإيقاف. ضع مرشح حقنة معقماً في فتحة التهوية.

انقل الآن دائرة التدفق إلى حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية، و5% ثاني أكسيد الكربون. ثبّت الأنابيب الصلبة في رأس مضخة Master Flex الدوارة المخصصة للاستخدام مع هذا النوع من أنابيب Coal Palmer. تأكد من عدم تداخل الأنابيب مع مسارات تثبيت المضخة الدوارة.

حدد مكان خروج الأنابيب من رأس المضخة على كلا الجانبين باستخدام قلم تحديد. وبعد التأكد من أن جميع صمامات الإيقاف مغلقة تجاه منافذ العينات ومفتوحة على طول دائرة التدفق، ابدأ بتشغيل المضخة. ثم تحقق من اتجاه التدفق.

يجب أن ينتقل سائل PERFUSE eight من الخزان الزجاجي عبر الأنابيب الصلبة وصولاً إلى مخمد النبضات. لتجميع غرفة التدفق، استخدم قفازات معقمة لتوصيل قطعة من الأنابيب المرنة بطول بوصتين بمحول لور (lure adapter) أنثوي بمقاس 1/8 بوصة. ثم قم بتوصيل قطعة أخرى من الأنابيب المرنة بطول بوصتين بمحول لور (lure adapter) ذكري بمقاس 1/8 بوصة.

قم بتوصيل الأنبوب المرن بطول بوصتين المزود بمهايئ لور (lure adapter) أنثوي بفتحة الدخول، والأنوب المرن بطول بوصتين المزود بمهايئ لور ذكري بفتحة الخروج. قم بتركيب صنابير إيقاف رباعية الاتجاهات في كلا مهايئي اللور هذين. ثم قم بتوصيل قطعة الأنبوب المرن المتبقية بطول بوصتين بموصل الفتحة الجانبية الخارج من مصيدة الفقاعات، وقم بتركيب صنبور إيقاف أحادي الاتجاه باستخدام ملاقط معقمة.

قم بإزالة الشريحة المزروعة بالخلايا من وعاء استزراع الخلايا ووضعها في التجويف الموجود في اللوحة السفلية لغرفة التدفق. تأكد من وضع الشريحة بحيث يكون الجانب الذي يحتوي على الخلايا متجهاً للأعلى، ثم استخدم محقنة أو ماصة لوضع 10 milliliters من وسط EPC الدافئ فوق الشريحة المزروعة بالخلايا. اسمح للوسط بتغطية الشريحة داخل غرفة التدفق، مع الحرص على عدم سكب الوسط فوق الحلقة الدائرية (O-ring) الموجودة على اللوحة السفلية.

ضع اللوح العلوي لغرفة التدفق فوق اللوح السفلي، مع محاذاة فتحات البراغي. حافظ على توازي اللوحين لتجنب إدخال فقاعات هواء إلى غرفة البراغي. قم بتثبيت اللوحين معاً. وباستخدام مفك براغي أوتوماتيكي يعمل بالبطارية، قم بتفريغ مصيدة فقاعات التدفق الداخل عن طريق فتح صمام الغلق أحادي الاتجاه المتصل بمنفذ مصيدة فقاعات جانب التدفق الداخل.

استخدم محقنة سعة 10 مل لشطف أنابيب التدفق الداخل بلطف باستخدام وسط EPC، ثم أغلق صمام التوقف هذا وقم بتغطيته. الآن، قم بتفريغ الهواء من قناة الغرفة عن طريق فتح صمام التوقف رباعي الاتجاهات الخاص بمنفذ التدفق الخارج وشطف وسط EPC بلطف عبر غرفة التدفق. وباستخدام محقنة سعة 10 مل مرة أخرى، قم بتغطية جميع وصلات صمامات التوقف رباعية الاتجاهات وإغلاقها.

انقل غرفة التدفق إلى الحاضنة المرطبة مع دائرة التدفق المجمعة. أوقف مضخة دائرة التدفق، وأغلق صمامات الإيقاف في اتجاه التدفق لمنع التسرب.

قم بتوصيل غرفة التدفق بدائرة التدفق. بعد توصيل غرفة التدفق بدائرة التدفق، افتح صنابير الإيقاف في اتجاه التدفق. قم بتشغيل مضخة التدفق مرة أخرى وتأكد من أن PERFUSE eight يتدفق في الاتجاه الصحيح. اضبط معدل التدفق للوصول إلى إجهاد القص المطلوب.

أثناء تجربة التدفق، يمكن إزالة غرفة التدفق من الدائرة لتصوير الخلايا عبر المجهر الضوئي أو المجهر الفلوري. للقيام بذلك، افصل غرفة التدفق من دائرة التدفق عند وصلات صمام الغلق بصمام الغلق. لجمع ثماني عينات من سائل التروية للتحليل.

أولاً، أوقف المضخة مؤقتاً، وأغلق صمام الإيقاف الموجود في أقرب نقطة من مخمد النبضات. قم بإزالة الغطاء الواقي، وضعه مقلوباً لضمان عدم تلوثه. ثم أدخل محقنة صغيرة في منفذ العينة.

أغلق صمام التوقف في اتجاه غرفة التدفق، مع إبقاء منفذ العينة والدائرة في اتجاه مخمد النبضات مفتوحين. اسحب الكمية المطلوبة من العينة من الدائرة، ثم أغلق صمام التوقف باتجاه منفذ العينة قبل إزالة المحقنة. احفظ العينة الثامنة الوفيرة في قارورة محددة التسمية وجمّدها عند درجة حرارة -80 °C.

أغلق منفذ العينة وتأكد من أن جميع الصمامات مفتوحة قبل بدء التدفق. باستخدام هذه الطريقة، يمكن استزراع الخلايا السلفية البطانية المشتقة من دم الإنسان على شرائح التيتانيوم في غضون 15 دقيقة، حيث تلتصق تحت تأثير قوى القص الفسيولوجية. وكما هو موضح في هذا الشكل، تنتشر خلايا EPCs تحت تأثير التدفق من حوالي 210 square microns فور الاستزراع إلى حوالي 657 square microns بعد ثلاث ساعات، وحوالي 1, 152 square microns بعد 48 ساعة من إجهاد القص السوائلي بمقدار 15 dines per square centimeter.

توضح هذه الصورة المجهرية الضوئية التوجه العشوائي للخلايا السلفية البطانية (EPCs) البشرية. فبعد فترة استقرار استاتيكي لمدة ست ساعات تلت تدفقاً لمدة ثلاث ساعات بقوة 100 dines لكل سنتيمتر مربع، تكون الخلايا قد انتشرت ولكنها ظلت في توجه عشوائي. أما بعد 48 ساعة من إجهاد القص السوائلي بقوة 100 dines لكل سنتيمتر مربع، فتصبح الخلايا السلفية البطانية (EPCs) مصطفة وموجهة في اتجاه التدفق.

هنا، تم وسم الخلايا السلفية البطانية (EPCs) باستخدام CTO، بينما صُبغت نويات الخلايا بـ herx ليتم تحديدها بعد التدفق. وللمقارنة، تُظهر هذه الصورة الخلايا السلفية البطانية الخنزيرية على شرائح تيتانيوم في اتجاه موازٍ لاتجاه التدفق. وبعد 48 ساعة من التدفق والتعرض لإجهاد قص بمقدار 15 dines لكل سنتيمتر مربع، صُبغت حدود الخلايا بصبغة anti pcam والنويات بصبغة cytoxin للحمض النووي.

تسمح هذه الطريقة أيضاً بالحصول على عينات من جهاز PERFUSE eight في نقاط زمنية محددة مسبقاً لتحليل و/أو قياس كمية نواتج الأيض الخلوية المفرزة. يظهر هنا مثال على إنتاج النيتريت خلال تجربة تدفق استمرت لمدة 48 hour باستخدام خلايا EPCs الخنزيرية. ومن المهم جداً الحفاظ على التعقيم طوال فترة تنفيذ هذا الإجراء.

بالإضافة إلى ذلك، من المهم اتخاذ الخطوات اللازمة لتقليل عدد فقاعات الهواء في غرفة التدفق قبل بدء التدفق المستمر، حيث يمكن أن تتسبب هذه الفقاعات في تمزق الخلايا. كما نوصي بفحص كل وصلة في غرفة التدفق والدائرة الكهربائية قبل عملية التروية لمنع تسرب PERFUSE eight أثناء التجربة. تم تصميم هذه الغرفة بحلقات دائرية (O-rings) مدمجة تتيح تقابلاً كاملاً بين اللوحين العلوي والسفلي وتوفر إغلاقاً مانعاً للتسرب دون الحاجة إلى مضخات تفريغ.

تضمن هذه الميزة أيضاً ثبات ارتفاع الغرفة بين التجارب، وتلغي الحاجة إلى الحشيات المطاطية أو التعديلات. تستخدم غرفة التدفق لدينا شرائح مجهرية قياسية؛ وبناءً على ذلك، يتوفر عدد كبير من الخلايا لإجراء المزيد من التجارب.

على سبيل المثال، يمكن تقييم RNA وDNA المستخلصين من الخلايا بعد التدفق لدراسة تخليق البروتين أو التعبير الجيني. يتيح تصميم الدارة الخاص بنا جمع ثماني عينات من سائل التروية لتحليل وقياس نواتج أيض الخلايا، مثل النتريت، وهو ناتج أيضي تأكسدي أساسي لأكسيد النيتريك الذي تفرزه الخلايا تحت تأثير إجهاد القص السائل. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تجميع غرفة التدفق ودارة التدفق المعقمة لإخضاع الخلايا الملتصقة لإجهاد القص السائل.